徐偉麗 牛玲玲 王文俠 崔鵬舉

1. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院食品科學(xué)系，哈爾濱 150090 2. 齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，齊齊哈爾 161006

Wnt信號(hào)通路在各種生物中具有高度的保守性，對(duì)于細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)、凋亡及細(xì)胞功能的表達(dá)都有重要作用，為生物生長(zhǎng)發(fā)育所必需。Wnt信號(hào)通路包含3條通路：經(jīng)典Wnt/ β-catenin信號(hào)通路，非經(jīng)典Wnt/鈣離子(Wnt/Ca2+)通路和Wnt/PCP(planar cell polarity，PCP)通路。與經(jīng)典通路相比，非經(jīng)典通路并不依賴(lài)胞內(nèi)的β-catenin，而是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度或細(xì)胞極性來(lái)實(shí)現(xiàn)其功能[1,2]。目前，人類(lèi)基因研究和小鼠實(shí)驗(yàn)都證明Wnt信號(hào)通路在調(diào)控骨形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Wnt信號(hào)通路在骨形成中核心作用的確認(rèn)，使它成為開(kāi)發(fā)防治骨骼類(lèi)疾病新藥的非常有吸引力的目標(biāo)[1]。該信號(hào)通路已成為目前骨骼系統(tǒng)相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制和骨代謝研究的新熱點(diǎn)，現(xiàn)就相關(guān)報(bào)道綜述如下。

1 經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)理

Wnt/β-catenin通路的主要作用機(jī)制(見(jiàn)圖1)是胞外的Wnt蛋白與膜上的受體蛋白復(fù)合物結(jié)合(由卷曲蛋白(Frizzled，F(xiàn)z)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LDL receptor related protein，LRP5/6組成)，激活胞內(nèi)的散亂蛋白(Dishevelled，Dvl)誘導(dǎo)胞內(nèi)的四聚體(APC、Axin、GSK-3β、β-catenin)解體，從而使細(xì)胞內(nèi)的β-catenin濃度升高，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子(T cell factor / lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)結(jié)合，最終誘導(dǎo)靶基因(cyclinD1、c-myc、Runx2、Osx等)的表達(dá)。在沒(méi)有Wnt蛋白存在的情況下，四聚體將β-catenin泛素化標(biāo)記并最終通過(guò)泛素化途徑降解，使其濃度降低而抑制靶基因的表達(dá)[3]。

圖1 經(jīng)典Wnt信號(hào)通路[4]Fig.1 Classic Wnt signaling[4]

2 與骨代謝相關(guān)的胞外成分—— Wnt

Wnt蛋白家族由19種分泌型富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)組成，在骨細(xì)胞形成和骨構(gòu)建過(guò)程中起重要作用[5]。Wnt1類(lèi)(Wnt1和Wnt3a)與經(jīng)典Wnt通路相關(guān)，它通過(guò)和卷曲蛋白、LRP5/6形成復(fù)合蛋白來(lái)激活經(jīng)典Wnt通路[6]。該復(fù)合體會(huì)引起GSK3β的磷酸化并導(dǎo)致其失活，這一過(guò)程能夠抑制β-catenin的降解，促進(jìn)其在細(xì)胞核中積累進(jìn)而發(fā)揮作用[7]。非經(jīng)典的Wnt5a類(lèi)和卷曲蛋白結(jié)合，激活三聯(lián)體G偶聯(lián)蛋白，并且通過(guò)C依賴(lài)蛋白激酶系統(tǒng)或者JNK依賴(lài)的蛋白激酶來(lái)提高胞內(nèi)的鈣離子濃度，從而影響細(xì)胞骨架的形成[8]。

Wnts能夠通過(guò)經(jīng)典和非經(jīng)典通路抑制成熟的成骨細(xì)胞凋亡，從而延長(zhǎng)它的壽命[9]。Wnts也能夠直接作用于破骨細(xì)胞，降低破骨細(xì)胞中的β-catenin濃度從而增加破骨細(xì)胞的數(shù)目，增加骨吸收，降低骨量[10]。最新研究發(fā)現(xiàn)，在早發(fā)型骨質(zhì)疏松和成骨不全癥患者的常染色體中，Wnt1基因發(fā)生了錯(cuò)義突變[11]。

由骨細(xì)胞分泌的硬骨素(Sclerostin)，能夠和Wnt蛋白競(jìng)爭(zhēng)LRP5/6在胞外的結(jié)合位點(diǎn)。硬骨素的缺乏，會(huì)啟動(dòng)Wnt信號(hào)通路，從而導(dǎo)致人和鼠體內(nèi)的骨量急劇上升。處在失重狀況下的宇航員會(huì)快速的流失大量骨質(zhì)，就是由于骨細(xì)胞響應(yīng)相關(guān)的機(jī)械刺激，分泌的硬骨素升高造成的[12,13,14]。甲旁腺素(parathyroid hormone，PTH)能夠抑制骨細(xì)胞產(chǎn)生硬骨素，從而通過(guò)Wnt通路增加骨量來(lái)治療骨質(zhì)疏松，這也是目前唯一被廣泛認(rèn)可的治療方案[15]。硬骨素的人源單克隆抗體—Romosozumab，能夠升高骨密度(bone mineral density，BMD)并促進(jìn)骨形成，減少骨重吸收。在一項(xiàng)針對(duì)低BMD的絕經(jīng)后婦女實(shí)驗(yàn)中(為期1年)，Romosozumab作用組BMD的增長(zhǎng)幅度(11.3%)比bisphosphonate alendronate(4.1%)和PTH(7.1%)都要大[16]。目前這個(gè)藥物已進(jìn)入三期臨床試驗(yàn)階段，進(jìn)一步驗(yàn)證它對(duì)BMD的確切療效及長(zhǎng)期服用的副作用[17]。

3 與骨代謝相關(guān)的胞內(nèi)成分

3.1 Axin

脊椎動(dòng)物的兩種Axin基因分別表達(dá)Axin和Axin2蛋白。兩者的功能相似，但是Axin持續(xù)表達(dá)，而Axin2只有在Wnt通路激活時(shí)才表達(dá)，并且起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用；另外，Axin廣泛表達(dá)，而Axin2只在特定的組織表達(dá)[18]。人類(lèi)Axin2的基因突變有可能導(dǎo)致遺傳性牙齒發(fā)育不全、直腸癌等[19]。在人胚胎早期，母體缺乏Axin會(huì)導(dǎo)致最初的糖原降解滯后。對(duì)S2細(xì)胞進(jìn)行Axin-RNAi實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明內(nèi)源性糖原水平以及GSK3β都有所升高[20]。

Axin是四合體的骨架蛋白，N末端的RSG區(qū)域和APC(adenomatous polyposis coli)結(jié)合。C末端的DIX區(qū)域和散亂蛋白的相關(guān)區(qū)域功能類(lèi)似，主要促進(jìn)兩者間的相互作用。另外還有單獨(dú)作用于β-catenin、GSK-3β和CKIa的區(qū)域以及與磷酸酶PP2A作用的區(qū)域。當(dāng)Wnt蛋白與LRP5結(jié)合后，Axin就被征募到細(xì)胞膜，與LRP5的胞內(nèi)區(qū)域相互作用，進(jìn)而阻止Axin參與β-catenin的降解過(guò)程[21]。Wynne Peterson-Nedry等發(fā)現(xiàn)完全敲除果蠅Axin上APC、GSK3或β-catenin結(jié)合位點(diǎn)，也只是導(dǎo)致中度的發(fā)育遲緩，因此他們認(rèn)為Axin和另外的三聚體結(jié)合，主要作用是大大提高復(fù)合體的穩(wěn)定性[22]。

3.2 GSK-3β

糖原合成酶激酶-3(Glycogen synthase kinase 3，GSK-3)是一種絲氨酸(S)/蘇氨酸(T)激酶，在哺乳動(dòng)物中有α(51ku)和β(47ku)兩種類(lèi)型。GSK的酶活性受磷酸化位點(diǎn)的影響：GSK3β的9位和GSK3α的21位絲氨酸磷酸化是非活性形式，GSK3β的216位和GSK3α的279位酪氨酸磷酸化是活性形式[23]。GSK-3β在Wnt信號(hào)途徑中通過(guò)與Axin結(jié)合磷酸化β-catenin末端的3個(gè)絲氨酸/蘇氨酸(S33，S37，T41)，促進(jìn)β-catenin被特定的泛素酶系統(tǒng)識(shí)別。Axin上也有CKIα的結(jié)合位點(diǎn)，其主要是通過(guò)磷酸化β-catenin的45位絲氨酸，來(lái)促進(jìn)GSK-3β的磷酸化過(guò)程。在細(xì)胞內(nèi)GSK3β還可以磷酸化Wnt通路的其他成分如Axin，APC等，這一作用能夠增強(qiáng)它們與β-catenin結(jié)合的能力，并提高Axin的穩(wěn)定性[24]。Dvl與Fz/LRP復(fù)合體結(jié)合后被激活，然后將GBP帶入四聚體復(fù)合物，可使GSK-3β從Axin上解離，抑制β-catenin的降解[25]。

GSK3β對(duì)成骨細(xì)胞的形成和分化有重要的影響。實(shí)驗(yàn)表明GSK-3β的抑制劑如LiCl能夠使骨質(zhì)疏松的小鼠骨量增加，骨礦物質(zhì)密度顯著提高[26]。鋰雖然被用來(lái)治療極性功能紊亂病，但是卻會(huì)造成病人骨礦化密度降低[27]，對(duì)其進(jìn)一步跟蹤研究表明，停止服用后有增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)，[28]。Gregory等用GSK3β抑制劑(2’Z, 3’E)-6-bromoindirubin-3’-oxime(BIO)作用于斑馬魚(yú)(zebrafish)，發(fā)現(xiàn)使用GSK3β的抑制劑能夠促進(jìn)魚(yú)鰭再生[29]。Sisask等將GSK3β的抑制劑AZD2858作用于股骨骨折的小鼠，作用一周后能明顯增加骨痂中骨礦化密度和升高骨礦物質(zhì)含量，在沒(méi)有先形成軟骨組織的情況下快速治愈骨折[30]。這些研究結(jié)果表明GSK3β是骨質(zhì)疏松預(yù)防治療的靶點(diǎn)。但是，由于GSK-3β分布廣泛，而且它在多種信號(hào)通路中同時(shí)存在，與人的多種疾病如神經(jīng)系統(tǒng)錯(cuò)亂、糖尿病、炎癥、癌癥、心力衰竭等密切相關(guān)，所以限制了它在治療骨質(zhì)疏松癥中的應(yīng)用[31]。

GSK-3β對(duì)破骨細(xì)胞的形成也有重要的影響，GSK3β的非活性狀態(tài)對(duì)于單核巨噬細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞尤為重要。有報(bào)道指出GSK3β的非活性形式促進(jìn)了破骨細(xì)胞的形成[32]；而采用抑制上游調(diào)控因子RANKL的方式抑制GSK3β的表達(dá)，會(huì)抑制破骨細(xì)胞的形成。因此，關(guān)于GSK對(duì)于破骨細(xì)胞形成的確切作用機(jī)制還不清楚，仍需進(jìn)一步研究[33]。

3.3 β-catenin

β-catenin由染色體3p21-22的CTNNbl基因編碼，其N(xiāo)端由130個(gè)氨基酸組成，是GSK-3β的作用位點(diǎn)。C末端的100個(gè)氨基酸主要通過(guò)與LEF/TCF結(jié)合發(fā)揮作用。中間連接臂還有550個(gè)氨基酸[34]。β-catenin主要通過(guò)胞質(zhì)中的濃度起作用。在沒(méi)有Wnt存在的情況下，其一端被固定在細(xì)胞膜上，另一端與GSK-3β、APC、Axin結(jié)合，被GSK-3β磷酸化標(biāo)記后，通過(guò)泛素化酶水解系統(tǒng)降解，保持低濃度。在Wnt存在的情況下，通路被激活，四聚體復(fù)合物解體，β-catenin降解不發(fā)生，高濃度的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核中發(fā)揮作用[6]。

體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均證明β-catenin是影響Runx2基因表達(dá)的重要因素，可以通過(guò)抑制間質(zhì)細(xì)胞Runx2基因的表達(dá)，從而抑制間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)其轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞[35]。Holmen等在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞中β-catenin基因的缺失會(huì)導(dǎo)致幾種骨質(zhì)疏松癥，并且影響成骨細(xì)胞的分化。在體內(nèi)試驗(yàn)中，成骨細(xì)胞中該基因的缺失會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)由核因子κ B受體活化因子配體(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B Ligand，RANKL)激活的骨保護(hù)素(Osteoprotegerin，OPG)和相關(guān)受體的改變，影響破骨細(xì)胞的生成。從而在基因?qū)用孀C明了破骨細(xì)胞中β-catenin的異常調(diào)節(jié)會(huì)導(dǎo)致骨發(fā)育不良，并證明了成骨細(xì)胞中的Wnt/β-catenin通路和破骨細(xì)胞的功能轉(zhuǎn)變相關(guān)[36]。

Xu等對(duì)480位絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者和170位正常絕經(jīng)后婦女調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，前者比后者血清中的β-catenin水平要低。在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者血清中，β-catenin與OPG正相關(guān)，跟RANKL/OPG、體重指數(shù)、硬骨素負(fù)相關(guān)。這說(shuō)明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病可能和血清中β-catenin濃度的降低和RANKL/OPG比率的升高有關(guān)[37]。

4 與骨代謝相關(guān)的核內(nèi)因子——Runx2/Cbfa1

Runx/Cbfa/Aml/Pebp轉(zhuǎn)錄因子家族包含3個(gè)單獨(dú)的基因。Cbfa1(Core binding factor a1)/Runx2(tunt related transcriptional factor a1) 能夠決定多功能間質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，其作用機(jī)理包括早期誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化和后期抑制它的凋亡[38]，在成骨細(xì)胞中的分布最多(在成骨細(xì)胞中，Cbfa1和骨鈣素基因、膠原蛋白Ia、骨唾液蛋白和骨橋蛋白的啟動(dòng)子區(qū)相結(jié)合)，在胸腺細(xì)胞和T細(xì)胞中也有表達(dá)。Cbfa1的遺傳突變會(huì)嚴(yán)重?fù)p害人的骨形成過(guò)程，這種疾病稱(chēng)為顱骨鎖骨發(fā)育不良綜合癥。小鼠體內(nèi)缺乏Cbfa1基因會(huì)導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞的分化受到抑制，造成骨形成不足[39]。小鼠細(xì)胞膜和軟骨細(xì)胞中如果完全缺少Cbfa1/Runx2或者不足單倍劑量的基因表達(dá)，都會(huì)導(dǎo)致中央軸空病(central core disease，CCD)的發(fā)生。已有證據(jù)表明，Runx2能夠同Lef1或TCF構(gòu)成復(fù)合體，結(jié)合在FGF18(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)啟動(dòng)子上，誘導(dǎo)骨發(fā)育調(diào)控因子FGF18的表達(dá)[40]。體外實(shí)驗(yàn)表明Runx2有多種調(diào)控作用，它能夠影響堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)的活性、誘導(dǎo)不成熟間質(zhì)干細(xì)胞中骨基質(zhì)蛋白基因的表達(dá)、成骨細(xì)胞的礦化等[41]。

5 與骨代謝相關(guān)的下游調(diào)控因子

經(jīng)典Wnt通路的下游調(diào)控基因有cyclinD1、c-myc、Runx2等。cyclinD1是細(xì)胞周期增殖信號(hào)的關(guān)鍵蛋白，主要調(diào)控細(xì)胞從G1期到S期，由β-catenin和LEF/TCF的復(fù)合體所激活[42]。c-myc基因同cyclinD1的作用類(lèi)似，它能夠加速細(xì)胞的周期過(guò)程，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化增殖[43]。核內(nèi)的Runx2基因是眾多信號(hào)通路調(diào)整的共同靶基因，它的表達(dá)能夠明顯刺激成骨細(xì)胞的增殖分化[1]。

6 展望

隨著人口數(shù)量的增加、社會(huì)人口老齡化的出現(xiàn)，骨骼類(lèi)疾病，特別是原發(fā)性骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)已經(jīng)成為老年人、尤其是老年婦女最為常見(jiàn)的疾病之一。由于其患病率和死亡率高，骨骼類(lèi)疾病現(xiàn)已成為公眾關(guān)注的健康問(wèn)題。經(jīng)典 Wnt/β-catenin通路對(duì)骨細(xì)胞的調(diào)控作用已經(jīng)得到廣泛的證實(shí)。該信號(hào)通路涉及骨骼類(lèi)疾病、癌癥等多種疾病的發(fā)生，特別是在骨骼類(lèi)疾病的發(fā)病和治療過(guò)程中扮演著重要角色，所以研究更加深入。近年來(lái)對(duì)Wnt/β-catenin通路的研究主要集中于兩個(gè)方向：一是細(xì)胞核內(nèi)下游靶基因的調(diào)控因子及調(diào)控路徑；二是影響通路的限制因子。Wnt通路的眾多組分為治療骨質(zhì)疏松提供了大量的潛在作用靶點(diǎn)如Dkk1，硬骨素，各調(diào)控因子的單克隆抗體等。但是整個(gè) Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中細(xì)胞因子如何調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的具體機(jī)制并不完全明確。另外，骨骼在形成過(guò)程中除了受到經(jīng)典和非經(jīng)典的Wnt通路的調(diào)控作用外，還涉及ER通路、osteoprotegerin receptor activator for nuclear factor κ B ligand(OPG/RANKL)通路、BMP-2/Smads通路、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路等的調(diào)節(jié)，它們的許多成分對(duì)細(xì)胞的作用相互重疊。這些通路之間如何聯(lián)系，仍未闡明。所以，除了各個(gè)通路成分單獨(dú)作用的效果外，該成分對(duì)其他通路的作用將成為另一個(gè)研究的熱點(diǎn)。