徐慧慧 趙宏艷 王貴 黃晶 郭明慧 肖誠

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029 2. 中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029 3. 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700

波爾定(Boldine)是從豆豉姜中提取的一種阿樸菲類異喹啉生物堿，豆豉姜為山雞椒Litseacubeba(Lour)Pers.的根及根莖, 是治療風(fēng)濕痹癥的常用藥之一，已有研究證明其對完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠具有較好的抑制作用[1]。課題組前期研究顯示波爾定可以改善II型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis, CIA)大鼠骨微結(jié)構(gòu)[2]，對CIA大鼠引起的骨質(zhì)疏松具有較好的抑制作用，但具體作用機(jī)制尚未明確。

正常的骨代謝依賴著骨吸收與骨形成的平衡，若這一過程受到破壞，骨吸收速度大于骨形成，則會引起骨量的丟失。破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)在骨吸收這一環(huán)節(jié)扮演著重要角色，其成熟過程與功能的正常與否將會直接影響體內(nèi)的骨量，從而進(jìn)一步影響骨組織的微觀結(jié)構(gòu)。所以本課題通過體外培養(yǎng)OC的方法，觀察波爾定對OC的分化功能及骨吸收功能的影響，以期探索波爾定改善骨組織微觀結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

小鼠單核細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。

1.2 試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素，美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)，美國BioTech公司；小鼠重組核因子κB受體活化因子配基(RANKL)，美國Peprotech公司；牛骨片，英國Immunodiagnostic Systems Limited公司；RIPA裂解液，美國Cell Signaling Technology公司；酒石酸鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；抗酒石酸磷酸酶(Tartrate Resistant Alkaline Phosphatase，TRAP)試劑盒、甲苯胺藍(lán)及磷酸對硝基苯酯，美國sigma公司；Trizol試劑，美國life technologies公司；CCK-8試劑盒，日本DOJINDO公司；引物合成，美國Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒，日本Takara公司。

1.3 藥物

波爾定由北京中醫(yī)藥大學(xué)柴興云博士提供，HPLC檢測后純度>98%。提取方法如下：總重50kg的干燥豆豉姜藥材，用10倍的95%乙醇提取2次，75%乙醇提取1次，每次2h?；厥找掖己蟮玫娇偨啵确螺腿『?，加NH3·H2O調(diào)PH10，以正丁醇萃取后經(jīng)硅膠柱色譜分離氯仿-甲醇梯度洗脫，得到18個流分(LB1-18)。其中的LB10經(jīng)硅膠柱色譜再次分離，乙酸乙酯-甲醇洗脫得到12個流分(LB10A-L)，最終將其中的LB10E經(jīng)ODS柱分離得到波爾定[3]。

1.4 主要儀器與耗材

細(xì)胞培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板，美國Corning公司；二氧化碳培養(yǎng)箱、Varioskan Flash全波長掃描熒光酶標(biāo)儀及分光光度計，美國Thermo Scientific公司；熒光定量PCR儀，美國Applied Biosystems公司。

2 方法

2.1 OC的誘導(dǎo)與培養(yǎng)

將RAW264.7細(xì)胞調(diào)節(jié)成2×103個/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞完全貼壁用含50 ng/ml RANKL及10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每2d換液一次，保持RANKL濃度不變。

2.2 分組與處理

按上述方法將RAW264.7細(xì)胞調(diào)節(jié)成2×103個/孔接種于預(yù)置無菌蓋玻片或牛骨片的96孔板中，待細(xì)胞完全貼壁用含50 ng/ml RANKL及10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時加入不同濃度波爾定進(jìn)行干預(yù)。共設(shè)六組，對照組和濃度分別為1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L的波爾定組，每組平行做三個復(fù)孔，所有檢測指標(biāo)重復(fù)三次。

2.3 破骨樣細(xì)胞計數(shù)

按上述方法培養(yǎng)至第4d，按TRAP染色試劑盒說明書方法進(jìn)行染色，計算整張玻片破骨樣細(xì)胞(TRAP染色陽性且細(xì)胞核多于3個的為破骨樣細(xì)胞)。

2.4 TRAP活性檢測

細(xì)胞培養(yǎng)至4 d，棄上清，每孔加入50 μl RIPA裂解液，冰上孵育10 min，離心后收集上清，轉(zhuǎn)移至新的96孔板中，加入50 μl TRAP 活性反應(yīng)液(100 mmol/L檸檬酸鈉，pH 5.0，50 mmol/L酒石酸鈉，5 mmol/L磷酸對硝基苯酯)，37℃避光孵育1 h后，加入50 μl的0.1 mol/L NaOH終止反應(yīng)，于405 nm波長檢測吸光度值。

2.5 細(xì)胞毒性實驗

將RAW264.7細(xì)胞以2×103個/孔的濃度接種至96孔板，按上述方法誘導(dǎo)至第4d，每孔加入10 μl CCK-8反應(yīng)液，37℃避光孵育3 h，于450 nm檢測吸光度值，計算細(xì)胞存活率。

2.6 骨吸收陷窩分析

細(xì)胞培養(yǎng)至第9天，取出骨片在 2.5%戊二醛中固定7 min。在 0.25 mol/L 氫氧化銨中以超聲清洗10 min 去除骨片上的細(xì)胞。經(jīng)系列乙醇(體積比分別為40%、75%、95%和100%乙醇)脫水，每次5 min，自然晾干后經(jīng)1%甲苯胺藍(lán)室溫染色5 min，用三蒸水沖洗后在100倍光學(xué)顯微鏡下觀察，采用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)計算骨陷窩面積。

2.7 Real time-PCR方法檢測RANK、NFATc1和c-fos mRNA表達(dá)

圖1 不同濃度波爾定對RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化影響 (×100)，與對照組(Boldine 0 μmol/L)比較：*P<0.05，**P<0.01Fig.1 TRAP staining shows the effect of boldine on RANKL-induced osteoclast (×100)，*P<0.05,**P<0.01 vs control group(Boldine 0 μmol/L)

細(xì)胞誘導(dǎo)至第4d，棄上清，加入1 ml TRIzol裂解液震蕩混勻至細(xì)胞完全裂解。提取細(xì)胞總RNA，瓊脂糖電泳法檢測RANK，NFATc1和c-fos mRNA基因濃度及完整性。所用引物為Invitrogen公司合成，引物序列為：RANK (157bp) 上游引物CCATCATCTTCGGCGTTTAC，下游引物TCTTGCTGACTGGAGGTTGC；NFATc1 (197bp)上游引物TCGGCGGGAAGAAGATGGT，下游引物GACTTGGACGGGGCTGGTTA；c-fos (129bp)上游引物CTTGAAGATGAGAAGTCTGCGTT，下游引物CTCTGGGAAGCCAAGGTCAT；內(nèi)參ACTIN (189bp)上游引物AGAGGGAAATCGTGCGTGAC，下游引物CCAAGAAGGAAGGCTGGAAAA。其他方法均參照試劑盒說明書進(jìn)行，并進(jìn)行擴(kuò)增曲線和溶解曲線分析。根據(jù)檢測結(jié)果，按照2-△△ct相對定量計算公式計算出各組目的基因相對定量結(jié)果。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 波爾定對破骨細(xì)胞分化的影響

RAW264.7細(xì)胞為圓形的單核細(xì)胞，體積較小。加入RANKL后，單核細(xì)胞逐漸融合匯聚，體積逐漸增大，誘導(dǎo)至4d分化為多核的OC。TRAP為OC特異性標(biāo)志酶，成熟的OC對TRAP染色呈陽性。TRAP染色陽性細(xì)胞且細(xì)胞核≥3為破骨樣細(xì)胞。

與對照組相比，1 μmol/L和10 μmol/L波爾定對OC分化有下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異。20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L波爾定組OC數(shù)量明顯少于對照組(P<0.05)。結(jié)果見圖1。

3.2 波爾定對破骨細(xì)胞TRAP活性及毒性的影響

20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L波爾定組TRAP活性明顯降低，與對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。CCK-8結(jié)果顯示各濃度波爾定對OC均未產(chǎn)生毒性，說明波爾定對OC分化的抑制作用不是藥物毒性所致。結(jié)果見圖2及圖3。

圖4 不同濃度波爾定對破骨細(xì)胞所致骨陷窩吸收面積的比較(×100)Fig.4 The effect of boldine on osteoclastic bone resorption area(×100)

圖2 不同濃度波爾定對RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞TRAP活性的比較Fig.2 The effect of boldine on the TRAP activity of RANKL-induced osteoclast

圖3 不同濃度波爾定對RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞毒性的比較Fig.3 The effect of boldine on the cell viability of RANKL-induced osteoclast

3.3 波爾定對破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響

藥物干預(yù)9d后，骨片經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，對照組、1 μmol/L和10 μmol/L波爾定組可見明顯骨吸收陷窩，邊界清晰，呈大小不等的圓形或臘腸形。骨吸收陷窩面積隨著波爾定濃度的提高呈減小趨勢，20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L濃度波爾定組陷窩面積明顯低于對照組(P<0.05，P<0.01)。

3.4 波爾定對破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的影響

與對照組相比，20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L波爾定可明顯抑制RANK基因的表達(dá)(P<0.05，P<0.01)；而且，對NFATc1和c-fos基因表達(dá)的抑制作用隨著藥物濃度的增加而更加顯著(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果見圖5。

圖5 不同濃度波爾定對破骨細(xì)胞分化基因RANK、NFATc1和c-fos mRNA表達(dá)的比較Fig.5 The effect of Boldine on mRNA expression of RANK, NFATc1 and c-fos in osteoclasts

4 討論

波爾定是從豆豉姜中提取出的一種阿樸菲類異喹生物堿，有報道顯示，波爾定能夠作為一種有效的抗氧化劑達(dá)到抗炎、抗腫瘤、抗糖尿病的效應(yīng)，在高血壓和糖尿病大鼠模型中可通過干擾氧化應(yīng)激介導(dǎo)的信號通路起到內(nèi)皮保護(hù)作用[4]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，波爾定可誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞凋亡，降低NF-κB信號通路的激活，在腫瘤的侵潤過程中起到重要抑制作用[5]。本課題組前期通過動物實驗研究顯示波爾定可以改善CIA大鼠骨組織微觀結(jié)構(gòu)，對CIA大鼠引起的骨質(zhì)疏松具有較好的抑制作用。骨質(zhì)疏松是由于骨代謝的失衡，破骨量大于成骨量所致。OC的分化或其功能的改變所導(dǎo)致的骨改建失衡是骨質(zhì)疏松的重要病理基礎(chǔ)[6]。所以本課題以O(shè)C為切入點，以期進(jìn)一步闡明波爾定改善骨組織微觀結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制。

OC是一類多核巨細(xì)胞主要來源于骨髓造血干細(xì)胞分化的單核/巨噬細(xì)胞系，在M-CSF和RANKL的存在下，可分化為破骨樣細(xì)胞[7]。目前應(yīng)用較多的是采用小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7誘導(dǎo)OC的方法進(jìn)行研究[8]，該細(xì)胞株在RANKL的刺激下可誘導(dǎo)為破骨樣細(xì)胞?？咕剖崃姿崦?TRAP)是OC的特異性標(biāo)志酶，通過TRAP染色可以計數(shù)OC的數(shù)量，本實驗研究發(fā)現(xiàn)20μmol/L波爾定即可抑制OC分化，更高濃度波爾定的抑制作用則更加明顯；TRAP活性檢測也得到了相同的研究結(jié)果。為進(jìn)一步檢測OC的功能，我們采用OC與牛骨片共培養(yǎng)的方法，進(jìn)一步顯示波爾定可明顯抑制OC的骨吸收功能。

RANK是RANKL的受體，位于OC及其前體細(xì)胞的細(xì)胞膜表面上。在OC成熟過程中，RANK發(fā)揮重要作用。當(dāng)與RANKL結(jié)合后可促進(jìn)單核細(xì)胞聚集從而分化為成熟的OC[9]，本研究發(fā)現(xiàn)20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L的波爾定可顯著抑制RANK mRNA的表達(dá)，說明波爾定可能是通過降低RANK的表達(dá)，從而阻止其與RANKL的結(jié)合，從而抑制OC前體細(xì)胞的成熟來達(dá)到抑制OC分化和功能的目的。在OC分化過程中c-fos是一種重要調(diào)控因子，通過啟動NFATc1促進(jìn)OC的分化與骨吸收功能[10]。NFATc1是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，其與c-fos在OC融合過程發(fā)揮重要作用[11]，已有研究顯示NFATc1在無RANKL的條件下亦可刺激前體細(xì)胞分化成OC[12]。本研究顯示波爾定抑制了OC中NFATc1和c-fos的mRNA表達(dá)。

綜上，波爾定可以抑制OC分化成熟相關(guān)的特異性基因RANK、NFATc1和c-fos的表達(dá)，從而影響OC的分化成熟及骨吸收功能，這一研究為進(jìn)一步闡明波爾定改善骨組織微觀結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制提供了依據(jù)。