張夢(mèng)瑩，李　志，李雪琴，鐘　民，呂　坤

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院　1.中心實(shí)驗(yàn)室;2.風(fēng)濕免疫科，安徽　蕪湖　241001)

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)極化對(duì)痛風(fēng)炎癥反應(yīng)的影響

張夢(mèng)瑩1，李志2，李雪琴1，鐘民1，呂坤1

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院1.中心實(shí)驗(yàn)室;2.風(fēng)濕免疫科，安徽蕪湖241001)

【摘要】目的：了解體外誘導(dǎo)極化的M1和M2型巨噬細(xì)胞對(duì)尿酸鈉結(jié)晶(MSU)誘導(dǎo)的急性痛風(fēng)模型炎癥反應(yīng)的影響。方法：選用雄性BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、模型M1型巨噬細(xì)胞組和模型M2型巨噬細(xì)胞組。小鼠皮下氣囊注射MSU結(jié)晶誘導(dǎo)小鼠急性痛風(fēng)模型。體外將巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)極化為M1和M2型巨噬細(xì)胞，并分別注射于小鼠痛風(fēng)模型皮下氣囊。于炎癥誘導(dǎo)后4 h、12 h和24 h檢測(cè)不同組別皮下氣囊浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞數(shù)量變化，并應(yīng)用ELISA法測(cè)定囊內(nèi)灌洗液中IL-1β、TGF-β的水平。結(jié)果：①在4 h、12 h和24 h時(shí)間點(diǎn)模型組、模型M1型巨噬細(xì)胞組和模型M2型巨噬細(xì)胞組皮下氣囊炎性細(xì)胞均高于空白對(duì)照組(P<0.01)。在4 h時(shí)間點(diǎn)，模型組及模型M1型巨噬細(xì)胞組和模型M2型巨噬細(xì)胞組間皮下氣囊炎性細(xì)胞數(shù)量無(wú)差異(P>0.05)；而在12 h和24 h，模型M1型巨噬細(xì)胞組皮下氣囊炎性細(xì)胞高于模型組，而模型M2型巨噬細(xì)胞組皮下氣囊炎性細(xì)胞低于模型組(P<0.05)。②在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，模型組、模型M1型巨噬細(xì)胞組及模型M2型巨噬細(xì)胞組IL-1β均高于空白對(duì)照組(P<0.01);在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，IL-1β水平在模型組低于模型M1型巨噬細(xì)胞組(P<0.01)，而高于模型M2型巨噬細(xì)胞組(P<0.01)。TGF-β水平在模型組高于模型M1型巨噬細(xì)胞組(P<0.01)，而低于模型M2型巨噬細(xì)胞組(P<0.01)。結(jié)論：巨噬細(xì)胞的極化在痛風(fēng)炎癥反應(yīng)不同階段起到不同的作用。

【關(guān)鍵詞】巨噬細(xì)胞；尿酸鈉結(jié)晶；痛風(fēng)；IL-1β；TGF-β

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.04.004

痛風(fēng)是尿酸鈉或尿酸鈉結(jié)晶(monosodium urate monohydrate crystals，MSU)從超飽和的細(xì)胞外液沉積于組織或器官引起的一組臨床綜合征。臨床表現(xiàn)為急性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)石及慢性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性腎病，嚴(yán)重者可出現(xiàn)關(guān)節(jié)致殘、腎功能不全。近年來(lái)，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，肥胖人群增多，其發(fā)病率逐年增高，并有年輕化的趨勢(shì)。本文以鼠皮下氣囊痛風(fēng)模型為研究手段，探討痛風(fēng)的發(fā)作及自發(fā)緩解機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)雄性BALB/c 小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，由南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0006。實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)條件下常規(guī)飼養(yǎng)一周。

1.2藥品與試劑尿酸鈉(sigma 公司)；IL-1β和TGF-β ELISA試劑盒(美國(guó)RB公司)；DMEM 和RPMI1640培養(yǎng)液(Hyclone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶(碧云天公司)；LPS、IFN-γ、IL-4(Peprotech公司)；APC 標(biāo)記的抗小鼠CD206 抗體(BD公司)，APC 標(biāo)記的抗小鼠INOS抗體(Ebioscience公司) 。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1尿酸鈉結(jié)晶的制備無(wú)菌條件下將6 mL 1 mol/L NaOH 溶液、1 g 尿酸鈉加入194 mL蒸餾水混合并煮沸，經(jīng)攪拌使尿酸充分溶解，自然降溫，滴入1 mol/L的HCl調(diào)pH 值為7.0，溶液呈乳白色后立即離心，4 ℃冷卻1 h后離心收集結(jié)晶，置于180 ℃干燥箱烘2 h，低溫干燥。臨用前將尿酸鈉結(jié)晶100 mg，加9.9 mL PBS和0.1 mL 吐溫20，制備成10 mg/mL無(wú)菌尿酸鈉溶液。

1.3.2小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞極化及鑒定將小鼠頸椎脫臼處死后，無(wú)菌分離股骨和脛骨，用無(wú)菌1 mL注射器吸入L929條件DMEM培養(yǎng)基(含有20%小鼠成纖維細(xì)胞株L929培養(yǎng)3天的上清、20%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)，1 mL無(wú)菌注射器吸取培養(yǎng)基吹下骨髓內(nèi)容物入一無(wú)菌培養(yǎng)皿，并將細(xì)胞充分吹勻，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。在L929條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)，7 d后去除非貼壁細(xì)胞，再培養(yǎng)于完全RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1000 U/mL青霉素、100 U /mL鏈霉素)中，1天后貼壁細(xì)胞即為骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞。第8天后吸取上清以PBS洗滌2遍，再加入新的DMEM完全培養(yǎng)基，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求以IFN-γ(100 U/mL) 和LPS(100 ng/mL)共同刺激培養(yǎng)48 h，誘導(dǎo)出M1型巨噬細(xì)胞；以IL-4 (20 ng/mL) 刺激培養(yǎng)48 h誘導(dǎo)出M2型巨噬細(xì)胞。48 h后消化收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。同時(shí)收集細(xì)胞，用Trizol 提取總RNA，行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)M1型、M2型特異基因。qPCR反應(yīng)步驟如下：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性30 s，60 ℃延伸34 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。同一樣本3復(fù)孔，以GAPDH作為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以熒光定量PCR分析軟件BIO-RAD CFX Manager自動(dòng)進(jìn)行分析。其相對(duì)定量值使用比較Ct法進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算公式為2-ΔΔCt。

1.3.3小鼠皮下氣囊急性痛風(fēng)模型、分組及用藥將小鼠隨機(jī)分組，即空白對(duì)照組、模型組、模型M1和M2型巨噬細(xì)胞共4組，各組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只。小鼠第1天背部皮下注射滅菌過(guò)濾空氣5 mL,形成適當(dāng)大小的氣囊,隨后每天注入3 mL 空氣,使膨脹3天，第7 天皮下氣囊注射200 μL的MSU 10 mg/mL，即可誘導(dǎo)急性痛風(fēng)炎癥模型。空白對(duì)照組氣囊注射200 μL的PBS。其中同時(shí)，模型M1、M2型巨噬細(xì)胞組分別注射5×107/mL的M1、M2型巨噬細(xì)胞100 μL；空白對(duì)照組、模型組給予相應(yīng)體積的PBS。

1.4檢測(cè)MSU誘導(dǎo)的急性痛風(fēng)模型氣囊中炎性細(xì)胞和促炎癥因子各組小鼠誘導(dǎo)炎癥4 h、12 h和24 h時(shí)間點(diǎn)，向皮下氣囊注射2 mL PBS沖洗，按摩5 min，抽出灌洗液裝于5 mL的離心管中，1500 r/min離心5 min，上清液分裝于EP管中，于 -80 ℃冰箱保存待測(cè)，采用 ELISA 法檢測(cè)沖洗液中IL-1β和TGF-β的含量，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。且管底細(xì)胞進(jìn)行炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2結(jié)果

2.1對(duì)極化后的巨噬細(xì)胞行流式檢測(cè)巨噬細(xì)胞膜蛋白表達(dá)的差異是鑒定不同類(lèi)型巨噬細(xì)胞的重要方法。刺激細(xì)胞48 h 后，對(duì)已報(bào)道的M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志NOS2和M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志CD206的表達(dá)進(jìn)行了流式檢測(cè)(圖1) 。

圖1流式檢測(cè)體外極化的巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志的表達(dá)

2.2實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)刺激48 h后，用Trizol 提取消化細(xì)胞，提取總RNA，目的是對(duì)M1型和M2型巨噬細(xì)胞特征性的基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)體外誘導(dǎo)刺激之后，M1型和M2型特征性的相應(yīng)標(biāo)志的表達(dá)有著明顯的升高(圖2) 。經(jīng)流式細(xì)胞儀及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，證實(shí)體外誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1和M2型巨噬細(xì)胞極化成功。

**P<0.01,***P<0.01,M1vs. M2。

圖2qPCR檢測(cè)刺激后巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因的表達(dá)

2.3巨噬細(xì)胞對(duì)尿酸鈉誘導(dǎo)的小鼠急性痛風(fēng)模型炎性細(xì)胞數(shù)量的影響MSU結(jié)晶注入后在4 h、12 h和24 h時(shí)間點(diǎn)模型組、模型M1型巨噬細(xì)胞組和模型M2型巨噬細(xì)胞組皮下氣囊炎性細(xì)胞均高于空白對(duì)照組。4 h時(shí)間點(diǎn)，4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，各模型組與空白對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，3個(gè)模型組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而在12 h和24 h時(shí)間點(diǎn)，模型M1型巨噬細(xì)胞組皮下氣囊炎性細(xì)胞高于模型組，而模型M2型巨噬細(xì)胞組低于模型組。見(jiàn)表1。

2.4巨噬細(xì)胞對(duì)尿酸鈉誘導(dǎo)的小鼠急性痛風(fēng)模型炎癥因子的影響于4 h、12 h和24 h時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)各組皮下氣囊灌洗液中IL-1β和TGF-β水平。結(jié)果在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)模型組、模型M1型巨噬細(xì)胞組及M2型巨噬細(xì)胞組IL-1β均高于空白對(duì)照組;在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，模型M1型巨噬細(xì)胞組IL-1β水平高于模型組，而模型M2型巨噬細(xì)胞組IL-1β水平低于模型組。3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的TGF-β水平在模型M1型巨噬細(xì)胞組低于模型組，而模型M2型巨噬細(xì)胞組高于模型組。見(jiàn)表2。

組別n0h4h12h24h空白對(duì)照組6-2.81±0.903.48±0.861.26±0.18模型組6-17.80±3.2219.82±1.207.98±2.85模型M1型巨噬細(xì)胞組6-18.14±4.1626.64±2.03a18.48±3.28a模型M2型巨噬細(xì)胞組6-16.62±3.488.53±3.12a4.32±2.27aF31.62169.0256.91P<0.01<0.01<0.01

a與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型對(duì)照組比較P<0.05。

表2各組小鼠氣囊灌洗液中IL-1β、和TGF-β水平表達(dá)(n=6)

組別IL-1β/(pg/mL)TGF-β/(pg/mL)4h12h24h4h12h24h空白對(duì)照組30.45±4.3828.23±3.5627.82±3.7626.34±2.4728.32±5.6327.48±3.42模型組140.65±8.1296.91±9.4746.33±4.3232.92±3.1057.27±6.0438.39±5.13模型M1型巨噬細(xì)胞組250.68±10.75b213.37±6.75b87.69±7.86b4.02±0.58b36.79±5.03b24.62±4.32b模型M2型巨噬細(xì)胞組82.43±9.48b56.64±7.14b32.95±5.43b69.75±3.42b86.38±4.52b49.04±3.47bF754.52814.73141.85600.32137.8343.15P<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

b與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型對(duì)照組比較P<0.01。

3討論

近年來(lái)的體外研究提示單核巨噬細(xì)胞在單尿酸鈉觸發(fā)的初始炎癥反應(yīng)中起到核心作用。單核細(xì)胞在單尿酸鈉結(jié)晶刺激下產(chǎn)生一系列促炎癥因子，尤其是IL-1β[1-2]，一直以來(lái)被認(rèn)為是痛風(fēng)和單尿酸鈉結(jié)晶誘導(dǎo)的炎癥中的核心細(xì)胞因子[3-4]。在鼠的痛風(fēng)模型中，當(dāng)鼠敲除IL-1受體或注射IL-1阻滯劑rilonacept(列洛西普)后，單尿酸鈉注入踝關(guān)節(jié)腔引起的炎癥均顯著下降[5-6]。給急性痛風(fēng)患者注射抗IL-1因子拮抗劑，IL-1受體抗體(阿那白滯素)、IL-lβ抗體等均取得明顯療效，從而進(jìn)一步證實(shí)IL-1β在痛風(fēng)發(fā)病機(jī)制中的核心作用[7-8]。本文在不同實(shí)驗(yàn)組測(cè)IL-1β水平，旨在判斷不同干預(yù)因素下痛風(fēng)炎癥發(fā)作程度的差異。

痛風(fēng)性炎癥的自限性從希波克拉底時(shí)代開(kāi)始得到認(rèn)識(shí)，并得到近代實(shí)驗(yàn)室研究的支持[9]。急性痛風(fēng)短期內(nèi)治療的顯著功效也提示明顯的內(nèi)源性機(jī)制限制了炎癥的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β在痛風(fēng)的自發(fā)緩解中起到重要作用[10]。越來(lái)越多的證據(jù)提示單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)不僅在痛風(fēng)炎癥啟動(dòng)中而且在炎癥進(jìn)展及緩解中均起到軸心作用。體外研究提示，單尿酸鈉結(jié)晶刺激可使分離的單核細(xì)胞由分泌促炎因子的M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化成分泌抗炎因子TGF-β的M2型巨噬細(xì)胞[11]，該研究提示單核細(xì)胞可驅(qū)動(dòng)炎癥，而極化的巨噬細(xì)胞可緩解痛風(fēng)炎癥。然而其他研究顯示單尿酸鈉結(jié)晶在原位和骨髓誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞均起到促炎癥作用，而且巨噬細(xì)胞在啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[12-13]。故單尿酸鈉結(jié)晶體內(nèi)募集的單核巨噬細(xì)胞群的真正功能表型仍有爭(zhēng)議，甚至是相反的結(jié)論。大量證據(jù)表明單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)可因局部環(huán)境變化而表達(dá)不同的功能活性[14]。有研究提示單尿酸鈉結(jié)晶在鼠的腹腔痛風(fēng)模型中可募集單核細(xì)胞極化為具有促炎癥反應(yīng)的M1樣巨噬細(xì)胞[15]。而M2型巨噬細(xì)胞在痛風(fēng)的炎癥反應(yīng)中至今尚未見(jiàn)報(bào)道。本文的研究關(guān)鍵點(diǎn)在于，巨噬細(xì)胞不同的表型是否起到不同作用并參與了痛風(fēng)炎癥的發(fā)作與自發(fā)緩解。我們將小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)極化為M1和M2型巨噬細(xì)胞，分別注入單尿酸鈉誘導(dǎo)的痛風(fēng)皮下氣囊模型中，檢測(cè)不同組促炎癥因子IL-1β和抗炎因子TGF-β的水平。我們的研究提示M1型巨噬細(xì)胞注射入單尿酸鈉誘導(dǎo)痛風(fēng)模型，促使IL-1β水平升高，M1型巨噬細(xì)胞有促進(jìn)痛風(fēng)炎癥進(jìn)展持續(xù)的作用。而M2型巨噬細(xì)胞注射入單尿酸鈉誘導(dǎo)痛風(fēng)模型中，表現(xiàn)為IL-1β水平降低，而TGF-β水平升高，提示M2型巨噬細(xì)胞有拮抗痛風(fēng)炎癥，促進(jìn)炎癥緩解的作用。動(dòng)物痛風(fēng)模型并不能等同于人類(lèi)痛風(fēng)炎癥狀態(tài)，但巨噬細(xì)胞的極化可能在痛風(fēng)發(fā)生及緩解中起到一定的作用，為痛風(fēng)的治療提供一種思路。

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文章編號(hào)：1002-0217(2016)04-0320-04

基金項(xiàng)目：皖南醫(yī)學(xué)院中青年科研基金項(xiàng)目(WK2013F07)

收稿日期：2015-11-04

作者簡(jiǎn)介：張夢(mèng)瑩(1983-)，女，檢驗(yàn)師，(電話(huà))13955356393，(電子信箱)51591569@qq.com.

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】【中圖號(hào)】R 589.7A

Effects of differentiated macrophages on gouty inflammation

ZHANG Mengying,LI Zhi,LI Xueqin,ZHONG Min，LYU Kun

Central Laboratory,The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

【Abstract】Objective：To observe the effects of polarized M1 and M2 macrophages in vitro on monosodium urate (MSU) crystals-induced acute gouty inflammation.Methods:Male BALB/c mice,selected as experimental models,were randomly divided into group of blank control,models,M1 macrophages and M2 macrophages.Acute mouse gouty inflammation model was developed by subcutaneous injection of MSU crystals.M1 and M2 macrophages were polarized in vitro and injected into subcutaneous air sacs of gouty inflammation model.The levels of IL-1β and TGF-β in subcutaneous air sacs were dynamicaly detected by ELISA before and after infusion of macrophages.Results:①The number of infiltrate inflammatory cells from model group,M1 macrophage group and M2 macrophage group was significantly increased compared to the blank controls at 4 h,12 h,and 24 h(P<0.01),whereas remained no difference at 4 h among groups of models,M1 macrophages an M2 macrophages(P>0.05).However,the number of inflammatory cells of model group was significant lower than that of M1 macrophages group,but significant higher than that of M2 macrophages group at 12 h and 24 h after stimulation(P<0.05);②IL-1β level in model group and groups of M1 macrophages and M2 macrophages was higher than that of control group at 3 time points(P<0.01).IL-1β level in model group was lower than that of M2 macrophages group,yet higher than that of M1 macrophages group(P<0.01).Model group had higher TGF-β level than M1 macrophages group,but lower level than M2 macrophages group.Conclusion:Differentiation of macrophages may diversely function in the conversion of inflammation of the gout.

【Key words】macrophage;monosodium urate crystals;gout;IL-1β;TGF-β