殷　勤，施會敏，曲高婷，張愛青，甘衛(wèi)華

(南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院　兒科，江蘇　南京　210003)

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·基礎醫(yī)學·

5-ASA對炎癥性腸病大鼠結(jié)腸組織中TGFβ1/smads信號通路的影響

殷勤，施會敏，曲高婷，張愛青，甘衛(wèi)華

(南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院兒科，江蘇南京210003)

【摘要】目的：應用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的大鼠結(jié)腸炎模型研究TGFβ1/smads信號途徑在5-氨基水楊酸(5-ASA)抗炎過程中的作用。方法：80只Sprague-Dawley大鼠隨機分為對照組(n=20)、造模組(n=20)、TNBS+5-ASA口服組(n=20)、TNBS+5-ASA灌腸組(n=20)，采用疾病活動指數(shù)、大體評分和組織學評分評價TNBS誘導結(jié)腸炎的嚴重程度，通過RT-PCR和Western blot檢測TGFβ1、smad2、smad3、smad4和smad7 mRNA和蛋白的表達量。結(jié)果：造模組smad2、smad3、smad4 mRNA和蛋白表達量明顯下降，而smad7的mRNA和蛋白表達量明顯升高。5-ASA口服和灌腸均可以上調(diào)smad2、smad3和smad4 mRNA和蛋白表達，下調(diào)smad7的mRNA和蛋白表達，且5-ASA灌腸均優(yōu)于5-ASA口服。結(jié)論：5-ASA可能通過調(diào)節(jié)TGFβ1/smads途徑的信號轉(zhuǎn)導來改善腸黏膜炎癥。

【關鍵詞】TGFβ1；smads；5-氨基水楊酸；炎癥性腸病

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.04.003

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一類以反復發(fā)作和緩解為臨床特征的腸黏膜慢性炎癥性疾病[1-2]。5-氨基水楊酸(5-ASA)是治療炎癥性腸病的主要藥物之一[3]。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β,TGFβ)是一類分泌型多肽類生長因子，TGFβ/smads信號途徑在細胞及生物體的生長和發(fā)育過程中起重要作用，而且與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)密切相關。目前已知在炎癥性腸病中有TGFβ/smads信號途徑的參與[4]，而關于5-ASA是否能夠調(diào)節(jié)炎癥性腸病中的TGFβ/smads信號途徑，從而改善腸黏膜炎癥及損傷卻鮮有報道，本文應用TNBS誘導大鼠結(jié)腸炎模型并給予5-ASA治療，初步探討TGFβ/smads信號途徑在5-ASA抗炎過程中的作用。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物6～8周齡SPF級健康Sprague-Dawley大鼠80只，體質(zhì)量150～180 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。

1.1.2藥物與試劑TGFβ1、smad2/3、p-smad2/3、smad4、smad7、GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology，TGFβ1、smad2、smad3、smad4、smad7、GAPDH引物由上海生工生物工程設計合成。TNBS購自美國Sigma公司。5-ASA口服劑(美沙拉秦緩釋顆粒劑，艾迪莎)產(chǎn)自法國愛的發(fā)制藥集團。5-ASA灌腸劑(莎爾福灌腸液)產(chǎn)自瑞士Vifor AG Zweigniederlassung Medichemie Ettingen。

1.2實驗方法

1.2.1造模與取材大鼠飼養(yǎng)于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。實驗前適應性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)條件為：溫度(22±2)℃，濕度(55±5)%，正常飲食。實驗前一天禁水不禁食、24 h后隨機分為四組：對照組(n=20)、TNBS組(n=20)、TNBS+5-ASA口服組(n=20)、TNBS+5-ASA灌腸組(n=20)。實驗第1天，將5%TNBS和無水乙醇以體積比1∶1混合制成含2.5 mg/mL TNBS的50%乙醇溶液(造模液)，給大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉1 mL/kg體質(zhì)量麻醉。取蝶翼采血針，剪去針頭，取其后軟管，一端接上1 mL注射器，另一端涂上石蠟油后從肛門插入腸道，TNBS組、TNBS+5-ASA口服組和TNBS+5-ASA灌腸組給予100 mg/kg體質(zhì)量的造模液，對照組給予等體積的50%乙醇，在距離肛門8～10 cm處灌腸，灌好后拔出軟管，保持大鼠頭朝下倒立30 s左右，以保證混合液到達全部結(jié)腸。造模完成后，大鼠平臥至清醒，飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境，給予正常飲食，每日觀察其精神狀態(tài)、進食、活動和大便性狀等，并記錄其體質(zhì)量。每天取其糞便做隱血試驗。實驗第3天開始TNBS+5-ASA口服組和TNBS+5-ASA灌腸組分別給予100 mg/kg 5-ASA口服和灌腸，實驗第8天處死所有大鼠，取結(jié)腸組織并分成三部分，一部分置于凍存管中-70 ℃保存用于提取RNA，一部分置于凍存管中-70 ℃保存用于提取蛋白，剩余的組織放入4%多聚甲醛中進行固定，石蠟包埋后制備組織切片(厚度4 μm)。

1.2.2TNBS誘導的結(jié)腸炎嚴重程度評估每日記錄大鼠體質(zhì)量變化，觀察大便性狀，檢測大便隱血，按照Murthy等[5]制定的標準進行疾病活動指數(shù)(disease activity index scores,DAI)評分[6]。取材時肉眼觀察腸黏膜有無損傷、充血水腫及潰瘍，對結(jié)腸進行大體評分(colon macroscopic damage index,CMDI)，參考Wallace JL制定的標準[7]。光學顯微鏡下觀察結(jié)腸白細胞浸潤程度、杯狀細胞形態(tài)、血管密度及腸壁厚度，進行組織學評分(histopathological score,HPS)，參考Lahat G的評分標準[8]。

1.2.3RT-PCR提取大鼠結(jié)腸組織RNA并進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄條件為 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，所得到的cDNA在Mastercycler ep realplex4 PCR系統(tǒng)上進行RT-PCR反應，反應條件為95 ℃預變性1 min，隨后40個循環(huán)的95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。GAPDH作為內(nèi)參。TGFβ1、smad2、smad3、smad4、smad7、GAPDH的引物序列見表1。

表1PCR引物序列

引物序列TGFβ1上游5'-GGACTACTACGCCAAAGAAG-3'下游5'-TCAAAAGACAGCCACTCAGG-3'smad2上游5'-AAGCCATCACCACTCAGAATTG-3'下游5'-CACTGATCTACCGTATTTGCTGT-3'smad3上游5'-GGTGTGCGGCTCTACTACATT-3'下游5'-CTGGTCACTGTCTGTCTCCTGT-3'smad4上游5'-AGGTGGCTGGTCGGAAAG-3'下游5'-TTGGTGGATGTTGGATGGTT-3'smad7上游5'-GGTGCTCAAGAAACTCAAGGAG-3'下游5'-AGTAAGGAGGAGGGGGAGACT-3'GAPDH上游5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'下游5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'

1.2.4Western blot提取大鼠結(jié)腸組織總蛋白并測定蛋白濃度，每個樣品加40 mg蛋白進行SDS-PAGE電泳，320 mA 90 min轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，4 ℃孵育TGFβ1、smad2/3、p-smad2/3、smad4、smad7一抗過夜，然后室溫孵育二抗2 h，加顯影液后曝光，GAPDH作為內(nèi)參。

2結(jié)果

2.1TNBS誘導的結(jié)腸炎嚴重程度評估TNBS組大鼠在灌腸后出現(xiàn)厭食、懶動、豎毛，體質(zhì)量明顯減輕，糊狀或水樣的肉眼血便，并帶有較多的黏液和膿液；對照組大鼠僅在實驗第1～2天出現(xiàn)輕度厭食、倦怠和稀便，體質(zhì)量無減輕，糞便不帶有黏液和膿血；TNBS+5-ASA口服組和TNBS+5-ASA灌腸組出現(xiàn)輕度體質(zhì)量下降、厭食和懶動，糞便糊狀，無肉眼血便但糞便隱血試驗陽性，無黏液和膿液，其中5-ASA灌腸組略好于5-ASA口服組。期間各組體質(zhì)量數(shù)據(jù)見表1。從實驗第3天開始，TNBS組大鼠的DAI評分明顯增高，且維持在高水平，而TNBS+5-ASA口服組和TNBS+5-ASA灌腸組的DAI評分顯著低于TNBS組(圖1A)。TNBS組大鼠結(jié)腸與周圍組織器官粘連明顯，不易分離，剖開結(jié)腸后可見明顯充血水腫、出血、糜爛和散在潰瘍形成，重者可見壞死，腸壁顯著增厚；而TNBS+5-ASA口服組和TNBS+5-ASA灌腸組大鼠結(jié)腸與周圍組織粘連較輕，結(jié)腸壁有明顯充血水腫、出血和糜爛，但無潰瘍形成，亦無壞死；TNBS組、TNBS+5-ASA口服組和TNBS+5-ASA灌腸組的CMDI評分均高于對照組，而TNBS+5-ASA口服組和TNBS+5-ASA灌腸組低于TNBS組，其中5-ASA灌腸組低于5-ASA口服組(圖1C)。組織病理結(jié)果顯示TNBS組大鼠結(jié)腸黏膜上皮損傷、缺失、糜爛及潰瘍形成，固有層腺體變形、排列紊亂，黏膜及黏膜下層見密集分布的淋巴細胞，單核細胞及中性粒細胞浸潤，而TNBS+5-ASA口服組和TNBS+5-ASA灌腸組大鼠結(jié)腸黏膜上皮有輕度的損傷、缺失和糜爛，但無潰瘍形成，黏膜及黏膜下層淋巴細胞、單核細胞及中性粒細胞浸潤少于TNBS組，腸壁厚度也小于TNBS組(圖1B)；TNBS組HPS評分較對照組升高，而TNBS+5-ASA口服組和TNBS+5-ASA灌腸組均低于TNBS組，但5-ASA口服組和5-ASA灌腸組之間無統(tǒng)計學差異(圖1D)。

A.各組大鼠每日DAI評分；B.各組大鼠結(jié)腸組織HE染色(100×)；C.各組大鼠CMDI評分；D.各組大鼠HPS評分。

*與對照組比較P<0.05，#與TNBS組比較P<0.05，&與TNBS+5-ASA口服比較P<0.05。

圖1TNBS誘導的結(jié)腸炎嚴重程度評估

表2　各組大鼠體質(zhì)量變化　g

*與對照組比較P<0.05，#與TNBS組比較P<0.05。

2.2RT-PCR檢測TNBS誘導的結(jié)腸炎以及5-ASA治療后結(jié)腸組織中TGFβ1、smad2、smad3、smad4、smad7的表達RT-PCR檢測結(jié)果顯示四組的TGFβ1 mRNA表達量無統(tǒng)計學差異(圖2A，P>0.05)；TNBS組的smad2、smad3和smad4 mRNA的表達量均低于對照組(圖2B～D，P<0.05)，TNBS+5-ASA口服組和TNBS+5-ASA灌腸組的smad2、smad3和smad4 mRNA的表達量較TNBS組升高，而TNBS+5-ASA灌腸組高于TNBS+5-ASA口服組(圖2B～D，P<0.05)；TNBS組的smad7 mRNA的表達量較對照組升高(圖2E，P<0.05)，而TNBS+5-ASA口服組和TNBS+5-ASA灌腸組比TNBS組降低，但是兩組之間無統(tǒng)計學差異(圖2E，P<0.05)。

2.3Western blot檢測TNBS誘導的結(jié)腸炎以及5-ASA治療后結(jié)腸組織中TGFβ1、smad2/3、p-smad2/3、smad4、smad7的表達Western blot檢測結(jié)果顯示四組的TGFβ1和smad2/3蛋白表達量無統(tǒng)計學差異；而TNBS組的p-smad2/3和smad4蛋白表達量低于對照組，TNBS+5-ASA口服組和TNBS+5-ASA灌腸組均比TNBS組升高，TNBS+5-ASA口服組和TNBS+5-ASA灌腸組之間無統(tǒng)計學差異；smad7蛋白在TNBS組的表達量高于對照組，而口服5-ASA和5-ASA灌腸后其表達量均下降，其中5-ASA灌腸組低于5-ASA口服組(表3、圖3)。

*與對照組比較P<0.05，#與TNBS組比較P<0.05，&與TNBS+5-ASA口服比較P<0.05。

圖2TNBS誘導的結(jié)腸炎以及5-ASA治療后結(jié)腸組織中TGFβ1、smad2、smad3、smad4、smad7 mRNA的表達

表3TNBS誘導的結(jié)腸炎以及5-ASA治療后結(jié)腸組織中TGFβ1、smad2/3、p-smad2/3、smad4、smad7蛋白的表達量

組別TGFβ1smad2/3p-smad2/3smad4smad7對照組0.148±0.0932.633±0.9811.002±0.0922.116±0.8890.738±0.233TNBS組0.139±0.0682.750±0.7980.303±0.167*0.601±0.734*3.075±0.841*TNBS+5-ASA口服組0.124±0.0122.459±0.0671.527±0.872#1.018±0.336*#1.368±0.747#TNBS+5-ASA灌腸組0.126±0.0662.974±1.2341.342±0.374#1.315±0.454#0.681±0.446#&F值0.170.367.465.9619.73P值0.91330.78360.00150.00450.0000

*與對照組比較P<0.05，#與TNBS組比較P<0.05，&與TNBS+5-ASA口服組比較P<0.05。

1：對照組；2：TNBS造模組；3.TNBS+5-ASA口服組；4：TNBS+5-ASA灌腸組。

圖3TNBS誘導的結(jié)腸炎以及5-ASA治療后結(jié)腸組織中TGFβ1、smad2/3、p-smad2/3、smad4、smad7蛋白的表達

3討論

炎癥性腸病是一組未知原因的腸黏膜慢性炎癥性疾病。促炎性細胞因子(如IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α、INF-γ等)與抗炎性細胞因子(如IL-4、IL-10、IL-13、TGFβ等)之間的失衡是引起腸黏膜損傷的重要因素[9]。

TGFβ/smads信號途徑在細胞及生物體的生長和發(fā)育過程中起重要作用。在TGFβ1/smads信號途徑中，TGFβ1與膜受體的結(jié)合導致TβRⅡ磷酸化并激活TβRⅠ，TβRⅠ可以磷酸化并激活smad2和smad3，而磷酸化的smad2和smad3協(xié)同smad4轉(zhuǎn)位到細胞核中，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄過程[10]。smad6、smad7可以競爭性地結(jié)合TβRⅠ，進而抑制TGFβ/smads途徑的信號轉(zhuǎn)導。

smad3在TGFβ1介導的抗炎作用中起重要的作用，干擾smad3導致細胞對TGFβ1的反應性減弱，而smad3缺陷小鼠胃腸道T細胞浸潤明顯增加并有膿腫形成[11]。阻斷內(nèi)源性TGFβ1的活性導致炎癥因子的合成增加，說明TGFβ1在負調(diào)控人類腸道中炎癥因子的合成中起關鍵作用[12]。smad6和smad7的上調(diào)與TGFβ/smads信號途徑的抑制相關[10,13]，IBD病人腸黏膜組織和LPMCs中表達高水平的smad7。5-ASA是IBD的治療藥物之一，本研究應用TNBS誘導的大鼠結(jié)腸炎模型，并給予5-ASA口服和灌腸治療，發(fā)現(xiàn)TNBS誘導的大鼠結(jié)腸炎中TGFβ1和總smad2/3并沒有變化，但是p-smad2/3和smad4含量卻顯著下降，而smad7的表達明顯升高，我們推測這種情況的出現(xiàn)可能是IBD導致抑制性smad7的表達升高，smad7可以競爭性結(jié)合TβRⅠ，阻止了TβRⅠ結(jié)合并磷酸化smad2和smad3，因此盡管TGFβ1和總smad2/3并沒有變化，但是smad2/3磷酸化程度降低，從而抑制了TGFβ1/smads途徑的信號轉(zhuǎn)導，導致過度的炎癥因子的合成與釋放，抗炎因子與炎癥因子的平衡失調(diào)，造成腸黏膜損傷。而應用5-ASA可以顯著降低抑制性smad7的表達，解除了smad7對TβRⅠ的抑制作用，p-smad2/3和smad4的表達增加，激活TGFβ1/smads途徑的信號轉(zhuǎn)導，使得抗炎因子與炎癥因子得以平衡，因而可以改善TNBS誘導的大鼠結(jié)腸炎的癥狀以及腸黏膜炎癥。哺乳動物中TGFβ有TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3等三種異構(gòu)體，TGFβ超家族還有其他眾多成員，因此，雖然總TGFβ1沒有變化，但可能存在其他分子的代償性變化來調(diào)節(jié)smad2/3的磷酸化和TGFβ1/smads途徑的信號轉(zhuǎn)導，有待于進一步的研究。本研究還發(fā)現(xiàn)5-ASA灌腸組的效果要優(yōu)于5-ASA口服組，這可能與5-ASA主要在腸黏膜局部發(fā)揮作用的特性有關。

綜上所述，5-ASA對IBD的治療作用除了通過調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)的合成和炎癥細胞的功能以及清除反應性氧代謝產(chǎn)物之外，還可能通過調(diào)節(jié)TGFβ1/smads途徑的信號轉(zhuǎn)導來改善腸黏膜炎癥，5-ASA與TGFβ1/smads信號途徑激活劑協(xié)同治療可能是IBD的治療的新方向之一。

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文章編號：1002-0217(2016)04-0315-05

收稿日期：2016-01-27

作者簡介：殷勤(1968-)，女，副主任醫(yī)師，(電話)18951762773，(電子信箱)njyinqin@163.com;

【文獻標識碼】【中圖號】R 574.62A

5-aminosalicylic acid relieves the intestinal inflammation through the TGFβ1/smads signaling pathway in animal model of inflammatory bowel disease

YIN Qin,SHI Huimin,QU Gaoting,ZHANG Aiqing,GAN Weihua

Department of Pediatrics,The Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210003,China

【Abstract】Objective：To observe the effect of 5-aminosalicylic acid (5-ASA) on the TGFβ1/smads signaling pathway in 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)-induced colitis in rat models.Methods:Eighty Sprague-Dawley rats were equally randomized into control group,model group,TNBS+5-ASA(oral) and TNBS+5-ASA(enema) (n=20 for each).The severity of TNBS-induced colitis was assessed using the Disease Activity Index scores,Colon Macroscopic Damage Index and the Histopathological Score.Real-time PCR and western blot were then performed to examine the expression of TGFβ1,smad2,smad3,smad4 and smad7 in each group of rats.Results:Exposure to TNBS+ethanol resulted in a marked decrease in the mRNA and protein expression of smad2,smad3 and smad4,yet increase of smad7.Treatment with TNBS+5-ASA by oral or enema had up-regulated the mRNA and protein expression of smad2,smad3 and smad4,yet down-regulated the expression of smad7.Nevertheless,administration of 5-ASA by enema was superior to oral use in improving the intestinal inflammation and mucosal injury.Conclusion:5-ASA relieves the intestinal inflammation through the TGFβ1/smads signaling pathway in animal model of inflammatory bowel disease.

【Key words】TGFβ1;smads;5-ASA;inflammatory bowel disease

張愛青，男，副主任醫(yī)師，(電子信箱)njaiqing@njmu.edu.cn，通信作者.