陶宜楠，鄭　超，秦　雯，張環(huán)環(huán)，汪萌芽

(皖南醫(yī)學院　細胞電生理研究室,安徽　蕪湖　241002)

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·基礎醫(yī)學·

心血管中樞與心血管功能的同步記錄技術

陶宜楠，鄭超，秦雯，張環(huán)環(huán)，汪萌芽

(皖南醫(yī)學院細胞電生理研究室,安徽蕪湖241002)

【摘要】目的：建立心血管中樞與心血管功能的同步記錄技術，用于觀察心血管中樞活動和外周自主神經(jīng)功能活動，研究心血管中樞對心血管活動的調節(jié)。方法：取成年SD大鼠，用混合麻藥腹腔麻醉后，同步記錄延髓頭端腹外側區(qū)(rostral ventrolateral medulla,RVLM)神經(jīng)元單位放電活動、心電圖、血壓、呼吸肌肌電、體溫，并進行相關參數(shù)的分析。結果：可記錄到明確穩(wěn)定的神經(jīng)元單位放電活動等各項指標，在12只大鼠的RVLM中一共記錄了18個自發(fā)單位放電，其中連續(xù)放電有12個，周期性簇狀放電有6個。另外，兩種類型放電分別對應的同步記錄指標進行組間比較，僅呼吸肌肌電幅值差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在記錄各項指標時觀察到RVLM神經(jīng)元自發(fā)放電與血壓之間有相互影響。結論：同步記錄心血管中樞與心血管活動是一種實時可靠的在體動物實驗技術，為研究心血管各級中樞之間的相互作用提供了一種有效的方法。

【關鍵詞】在體；多通道同步記錄技術；細胞外單位放電記錄；大鼠

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.04.002

心血管中樞與心血管功能的同步記錄技術是將中樞在體細胞外記錄技術與外周生理指標同步記錄技術相結合，應用PowerLab八通道生理記錄儀，同步記錄多項生理指標，如中樞神經(jīng)元單位放電、血壓、心電、呼吸、體溫等，是一項用途廣泛的實驗技術。該技術的建立主要用于研究各級心血管中樞對外周心血管功能活動的調節(jié)。外周心血管活動主要接受自主神經(jīng)系統(tǒng)的調節(jié)，而自主神經(jīng)系統(tǒng)接受中樞下丘腦和延髓的調控，腦內(nèi)調節(jié)心血管活動的最基本的中樞就位于延髓，包括延髓頭端腹外側區(qū)(rostral ventrolateral medulla,RVLM)、延髓尾端腹外側區(qū)(caudal ventrolateral medulla,CVLM)等核團，其中RVLM也是腦內(nèi)其他心血管中樞調節(jié)交感心血管運動系統(tǒng)的重要聯(lián)系核團，且具有自發(fā)活動[1]，而其他心血管活動的調節(jié)中樞，分布于從脊髓到大腦皮層的各個水平，相互構成復雜的神經(jīng)網(wǎng)絡，通過不同的神經(jīng)遞質共同調節(jié)心血管活動。

RVLM區(qū)也有呼吸相關調節(jié)神經(jīng)元的分布。本實驗技術在原有的四通道記錄技術的基礎上，增加了通道數(shù)目，比如可以增加同步記錄呼吸肌肌電指標，用于反映中樞呼吸相關神經(jīng)元的活動。因此，該技術也為中樞心血管相關神經(jīng)元的鑒定提供了便利。本實驗平臺聯(lián)合應用美國A-M systems公司的放大器，將原有的金屬電極改為玻璃電極，玻璃電極的尖端相較于金屬電極而言不易被極化，且更有利于貼合神經(jīng)元，記錄神經(jīng)元的單位放電。

本實驗通過心血管中樞與外周心血管生理指標的同步記錄技術，通過不同的實驗設計，可進一步鑒定RVLM區(qū)心血管相關神經(jīng)元，以及為進一步研究心血管各級中樞間交互作用以及心血管中樞與外周心血管活動的相互影響提供基本的技術支持。

1材料與方法

1.1實驗動物成年SD雄性大鼠250～300 g，購自南京青龍山動物繁殖場。

1.2主要儀器設備和藥品腦立體定位儀(瑞沃德68000系列)、美國A-M Systems的刺激器(MODEL 2100)和放大器(MODEL 1800)、動物恒溫系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司)、常用手術器械、手術顯微鏡、雙層銅網(wǎng)電生理屏蔽罩和防震臺、不銹鋼同芯金屬電極、金屬參考電極、玻璃微電極、PowerLab八通道生理信號采集系統(tǒng)(AD Instruments，Australia)及其Chart Pro記錄和分析軟件、氨基甲酸乙酯、α-氯醛糖等。

1.3實驗方法

1.3.1外周生理指標同步記錄用氨基甲酸乙酯(700 mg/kg)和α-氯醛糖(35 mg/kg)混合腹腔麻醉大鼠后，將大鼠取仰臥位固定于手術板上，首先分離股動靜脈，將充滿0.02%肝素鈉生理鹽水的聚乙烯塑料導管插入股動脈向心端，通過三通管接口連接血壓傳感器并經(jīng)橋式放大器連接PowerLab記錄系統(tǒng)轉入計算機連續(xù)記錄血壓。股動脈插管后將大鼠置于有雙層銅網(wǎng)電生理屏蔽罩的防震臺上的恒溫毯上，用針式電極記錄標準肢體Ⅱ導聯(lián)心電圖。將2根針式電極插入大鼠右側腋中線第9肋下緣肋間外肌內(nèi)，兩根電極垂直放置，記錄呼吸肌肌電圖。將體溫換能器探頭插入大鼠肛門內(nèi)，進行體溫信號的采集[2]。

1.3.2RVLM神經(jīng)元在體細胞外記錄 頭部備皮后，大鼠取俯臥位固定于腦立體定位儀上。剪去顱頂部分皮膚，鈍性分離皮下組織和骨膜，暴露顱骨，3% H2O2擦拭充分止血，暴露前囟、人字縫和矢狀縫，用生理鹽水再次擦拭暴露出的顱骨，調節(jié)前囟、人字縫到同一水平面。使用玻璃電極定位前囟后，參照Paxinos and Watson 圖譜[3]定位RVLM：前囟后(AP)：-12.36～-12.00 mm，右旁開(ML)：1.9～2.4 mm，顱骨表面以下(DV)：10.2～10.7 mm。以顱骨鉆鉆顱開窗，冷光源照明，用彎針頭挑破硬腦膜、蛛網(wǎng)膜和軟腦膜。將玻璃電極(內(nèi)充2%滂胺天藍和0.5 mol/L的醋酸鈉溶液，電極電阻5～15 MΩ)移至RVLM處顱窗上方，緩慢垂直下調至核團頂端，2%鹽水瓊脂封窗。參考電極置于大鼠顱頂邊緣皮下。微調記錄電極尋找明確的細胞外電活動信號。記錄到信號后，等待30 min，待信號穩(wěn)定后，觀察RVLM區(qū)核團放電活動以及與心率、血壓等外周心血管指標間的相互關系。

實驗結束，大鼠斷頭取腦于4%甲醛溶液內(nèi)固定后，進行冠狀面切片，觀察滂胺天藍標記位置，并與圖譜中RVLM的位置進行比對，以鑒定記錄位點。

2結果

2.1PowerLab多通道同步記錄對12只大鼠進行RVLM區(qū)神經(jīng)元單位放電活動的記錄，并同步記錄大鼠的體溫、心電、血壓、呼吸。同步記錄的原始圖見圖1、2。

2.2RVLM神經(jīng)元單位放電12只SD大鼠共記錄到18個RVLM區(qū)神經(jīng)元單位放電，各取穩(wěn)定記錄的RVLM電信號20 min，用Chart Pro軟件檢測出的平均頻率作為放電頻率值。其放電類型有兩種，一種是連續(xù)放電(66.7%，12/18)，另一種是周期性簇狀放電(33.3%，6/18)。兩種放電類型分別見圖1、2中的RVLM神經(jīng)元單位放電。

A：RVLM區(qū)神經(jīng)元連續(xù)放電、體溫、心電、血壓、呼吸肌肌電信號的同步記錄，B：放大后的單位放電信號。

圖1多通道同步記錄的原始圖

圖2RVLM區(qū)神經(jīng)元周期性簇狀放電、體溫、心電、血壓、呼吸肌肌電信號的同步記錄

2.3兩種放電類型分別對應的同步記錄的各項生理指標間的比較對RVLM神經(jīng)元兩種類型的單位放電信號及各自對應的同步記錄的外周指標進行兩組間比較分析，其中僅兩種放電類型分別對應的同步呼吸肌肌電幅值間比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，其他指標組間比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。詳見表1。

2.4RVLM神經(jīng)元與外周心血管活動之間的相互影響實驗過程中，在穩(wěn)定記錄到各項生理指標時，通過股靜脈注入苯腎上腺素(10 μg/kg)鑒定所記錄到的RVLM心血管相關神經(jīng)元。對記錄到的4個RVLM神經(jīng)元單位放電進行鑒定，在注入苯腎上腺素之后，血壓升高，其中3個RVLM神經(jīng)元單位放電受到抑制，即為心血管相關神經(jīng)元(75%，3/4)。典型記錄結果見圖3。

針刺大鼠尾部，觀察到RVLM神經(jīng)元放電頻率明顯加快，同時血壓也逐漸上升，隨后放電頻率略有降低，血壓也略有下降，典型記錄如圖4所示。

表1兩種放電類型分別對應的同步記錄的各項生理指標

類型連續(xù)放電周期性簇狀放電t值RVLM放電頻率/Hz17.3±10.0a22.1±19.0b0.7RVLM放電幅值/μV1423.8±549.1a1196.3±563.6b0.8HRV(LF)/nu14.1±12.1a8.1±7.0b1.1HRV(HF)/nu11.2±6.7a6.3±4.3b1.6HRV(LF/HF)1.2±0.5a1.2±0.3b0.0心率/(次/min)397.4±61.0a429.8±36.5b1.2體溫/℃35.4±1.6a35.2±1.8b0.2收縮壓/mmHg112.1±19.6c102.0±31.6d0.8舒張壓/mmHg73.7±16.3c69.0±18.0d0.5平均動脈壓/mmHg86.5±12.2c80.0±13.2d1.0呼吸肌肌電頻率/(次/min)97.2±15.5e103.4±22.2f0.3呼吸肌肌電幅值/μV*46.8±31.0e21.1±11.2f2.4

n=12，b：n=6；c：n=10，d：n=5；e：n=11，f：n=5。HRV：心率變異性，HF：高頻，LF：低頻。nu:歸一化單位，nu=LF或HF功率×100/(總功率-極低頻功率)。

圖中箭頭指示注入苯腎上腺素。

圖3注射苯腎上腺素后RVLM神經(jīng)元放電及血壓變化

圖中箭頭指示給予大鼠尾部針刺刺激。

圖4刺激鼠尾RVLM神經(jīng)元放電與血壓的變化

3討論

本實驗采用心血管中樞與心血管功能的同步記錄技術，在整體水平進行心血管中樞RVLM核團放電活動與外周生理指標的同步記錄，在整個實驗過程中均能夠實時記錄各項指標的變化。通過對同步記錄的各項指標進行統(tǒng)計分析，結果顯示，各項指標參數(shù)與已報道的類似參數(shù)基本一致[1,4,6-7]，提示實驗方法及結果可靠。

已知相關文獻[4-5，7]中在RVLM區(qū)有與呼吸相關的神經(jīng)元。本次實驗記錄到兩種類型的RVLM神經(jīng)元單位放電活動，分別是連續(xù)放電和周期性簇狀放電。實驗過程中發(fā)現(xiàn)周期性簇狀放電的放電頻率基本上與呼吸節(jié)律同步，且從兩種類型放電及其相應的同步外周指標間的分析結果也可看出，僅呼吸肌肌電幅值間比較有顯著差異，我們的實驗結果也進一步說明在RVLM區(qū)有與呼吸相關的神經(jīng)元，RVLM神經(jīng)元與心血管活動和呼吸活動均有相關性[8]。同時，也可通過此方法剔除RVLM區(qū)非心血管相關神經(jīng)元，而只進行RVLM區(qū)心血管相關神經(jīng)元與外周心血管活動的研究。

RVLM是交感神經(jīng)活動和心血管功能的整合中樞，對于交感神經(jīng)活動和心血管活動具有重要的調節(jié)作用，同時外周活動也可以影響到RVLM。在穩(wěn)定記錄大鼠各指標信號時，發(fā)現(xiàn)隨著大鼠RVLM區(qū)神經(jīng)元單位放電信號的變化其血壓也會相應改變。在大鼠的尾部進行針刺刺激后，觀察到大鼠的血壓、RVLM神經(jīng)元放電均有相應改變。給予外周軀體刺激，通過外周傳入中樞，RVLM神經(jīng)元放電增加，引起血壓升高。RVLM在動脈血壓壓力感受器反射調節(jié)中也起到關鍵性的作用[9]。RVLM神經(jīng)元具有壓力敏感性，其放電活動可被升高的血壓所抑制。我們采取靜脈注射苯腎上腺素(10 μg/kg)[10]的方法來鑒別RVLM神經(jīng)元，觀察到血壓升高，RVLM神經(jīng)元自發(fā)放電的頻率降低甚至消失，待血壓恢復至注射之前的水平，RVLM自發(fā)放電頻率恢復，該結果與文獻報道一致[11-12]。以上結果顯示本實驗所建立的心血管中樞與心血管功能的同步記錄技術，既可以記錄到由中樞神經(jīng)活動變化引起的外周生理指標的變化，也可以記錄到外周生理指標改變時中樞神經(jīng)活動的變化。提示心血管中樞與心血管功能的同步記錄技術可作為研究心血管各級中樞之間交互作用及心血管中樞對外周心血管活動調節(jié)的一種可靠的實驗研究方法。

本實驗表明，通過心血管中樞核團放電活動與外周生理指標同步記錄技術，不僅可以觀察到腦區(qū)核團放電活動改變時，外周生理指標的變化，在外周生理環(huán)境發(fā)生改變時也能觀察到腦區(qū)核團放電活動發(fā)生改變。通過不同方面驗證實驗結果的可靠性，證明了心血管中樞核團放電活動與外周生理指標同步記錄技術的實用性。為研究各級心血管中樞之間的相互關系，以及心血管中樞對外周心血管活動的調節(jié)提供了技術支持。

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文章編號：1002-0217(2016)04-0311-04

基金項目：安徽省自然科學基金項目(1408085MH155);皖南醫(yī)學院博士科研啟動基金項目(201402)；國家自然科學基金項目(31271155;31200828)

收稿日期：2016-02-09

作者簡介：陶宜楠(1992-),女,2014級碩士研究生,(電話)18226701617,(電子信箱) 283092373@qq.com；

【文獻標識碼】【中圖號】R 331.38A

Establishment of simultaneous recording technique for observing cardiovascular center and cardiovascular activities

TAO Yi′nan,ZHENG Chao,QIN Wen,ZHANG Huanhuan,WANG Mengya

Cell Electrophysiology Laboratory,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

【Abstract】Objective：To establish a simultaneous recording technique for observing the activities of the cardiovascular center and peripheral autonomic nervous system in studying the regulation of the center on cardiovascular activities.Methods:Adult Sprague-Dawley rats were anesthetized with mixed anesthetic. The single-unit discharge of rostral ventrolateral medulla (RVLM) neurons, electrocardiogram (ECG), blood pressure (BP), respiratory muscle electromyogram and body temperature were simultaneously recorded and related parameters were analyzed.Results:Stable and clear single-unit discharge signal of neurons and other signals were well recorded. Eighteen spontaneous unit discharges were recorded in 12 rats, containing 12 continuous discharges and 6 periodical burst discharges. In addition, only the respiratory muscle electromyogram amplitude was significantly different (P<0.05) between two types of discharge groups. The interaction between the RVLM spontaneous neural discharge and blood pressure was observed when recording the indicators.Conclusion:The results indicate that the simultaneous recording technique is a real-time and reliable method for animal experiment in vivo, which may provide an effective technique for studying the interaction between cardiovascular and all levels of the central nervous system.

【Key words】in vivo; simultaneous recording technique by polygragh; extracellular single-unit recordings; rat

汪萌芽,男，教授，碩士生導師,(電子信箱)wangmy@wnmc.edu.cn，通信作者；

張環(huán)環(huán),女,副教授,碩士生導師,(電子信箱)anhuihh@163.com，通信作者.