章　瑞（云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650500）

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逆境脅迫對(duì)小麥幼苗生理生化指標(biāo)的影響*

章瑞
（云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650500）

摘 要：對(duì)逆境脅迫下玉米和小麥用TTC染色和曙紅染色，觀察染色情況測(cè)定發(fā)芽率，發(fā)現(xiàn)干旱下發(fā)芽率下降。以小麥為材料，研究干旱脅迫下，脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）、GSH和H2O2含量和抗氧化酶（POD、PPO）活性的變化.結(jié)果顯示在干旱脅迫下，脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）、GSH、H2O2的含量相對(duì)于對(duì)照組均有較明顯的上升趨勢(shì)，POD和PPO活性也表現(xiàn)出較大水平的提高。

關(guān)鍵詞：逆境脅迫 小麥 生理生化

植物常遭受的有害影響之一是缺水。當(dāng)植物耗水大于吸水時(shí)，組織內(nèi)水分虧缺。過(guò)度水分虧缺的現(xiàn)象叫干旱［1］。在水分虧缺嚴(yán)重時(shí)，植物會(huì)出現(xiàn)萎蔫，光合作用減弱，嚴(yán)重影響農(nóng)作物產(chǎn)量。而且，當(dāng)缺水時(shí)，正常的膜雙層結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)孔隙，滲出大量溶質(zhì)，喪失選擇透性。缺水時(shí)植物的另一個(gè)顯著響應(yīng)是由于溶質(zhì)累積滲透勢(shì)下降。植物在干旱脅迫下由“滲透感受器”感受外界脅迫信號(hào)，啟動(dòng)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［2］。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

玉米種子，小麥種子；正常生長(zhǎng)的小麥幼苗，干旱逆境處理的小麥幼苗。

1.2 測(cè)定方法

（1）種子發(fā)芽率的測(cè)定。各取50粒吸脹的玉米種子和小麥種子，沿胚的中心線切成兩半（嚴(yán)格區(qū)分兩個(gè)半粒）。其中50個(gè)半粒進(jìn)行TTC染色（30℃水浴 20 min），另50個(gè)半粒進(jìn)行曙紅染色（室溫染色10 min），根據(jù)兩種方法的染色情況，分別計(jì)算發(fā)芽率。

（2）脯氨酸（Pro）含量的測(cè)定。Pro的提取：分別取0.1 g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的幼苗→加入3 ml 3%磺基水楊酸（SSA）和少許石英砂→充分研磨→用2 ml 3%磺基水楊酸（SSA）洗研缽→5 000 rpm離心10 min→量上清液體積。

Pro的測(cè)定：上清液各2 ml→分別加入2 ml冰乙酸和2 ml茚三酮試劑→煮沸15 min→冷卻后→5 000 rpm離心10 min（若沒沉淀可省略此步驟）→分別測(cè)定A520。

（3）丙二醛（MDA）含量的測(cè)定。MDA的提?。悍謩e取0.1 g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組→加入3 ml10%TCA和少許石英砂→充分研磨→用2 ml10%TCA洗研缽→5 000 rpm離心10 min→量上清液體積。

MDA的測(cè)定：分別取上清液各2 ml→加入0.5%TBA（用10% TCA配制）2 ml→煮沸15 min→冷卻后→5 000 rpm離心5 min（視沉淀有無(wú)）→分別測(cè)定OD450和OD532。

C1為可溶性糖的濃度；C2為MDA的濃度。

（4）H2O2含量的測(cè)定。H2O2提取：分別取0.1 g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組→加入3 ml3%三氯乙酸（TCA）和少許石英砂→充分研磨→用2 mlTCA洗研缽→5 000 rpm離心10 min →量上清液體積。

測(cè)定：分別取上清液各4 ml →加入0.1%Ti（SO4）2［用20%（v/v）H2SO4配制］0.2 ml→搖勻→OD410.

圖1　干旱對(duì)過(guò)氧化酶活性的影響

（5）過(guò)氧化酶（POD）活性的測(cè)定。POD的提?。悍謩e取0.1 g實(shí)驗(yàn)材料→加入少許石英砂和3 ml提取液（50 mmol/L PBS，pH6.0， 內(nèi) 含0.1 mmol/ LEDTA，1%PVP）→充分研磨→轉(zhuǎn)入離心管中→用2 ml提取液洗研缽→5 000 rpm離心10 min→量上清液體積→用于測(cè)定POD和PPO酶活性或分裝后轉(zhuǎn)至-20或-80℃保存。

POD測(cè)定：取POD反應(yīng)混合液（10 mmol/L愈創(chuàng)木酚，5 mmol/L H2O2，用PBS溶解）3 ml，加入酶液50 ul（空白調(diào)零用提取液取代），立即記時(shí)，搖勻，讀出反應(yīng)0.5和1.5 min時(shí)的A470。

PPO測(cè)定：取PPO反應(yīng)混合液（20 mmol/L鄰苯二酚，用PBS溶解）3 ml，加入酶液0.1 ml（空白調(diào)零用提取液取代），立即記時(shí)，搖勻，讀出反應(yīng)0.5和1.5 min時(shí)的A410。

以每分鐘A值變化0.01所需要的酶液的量為一個(gè)活力單位（U），則：

（6）GSH含量的測(cè)定。GSH的提?。悍謩e取0.1 g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的幼苗→加入3 ml3%三氯乙酸（TCA）和少許石英砂→充分研磨→用2 ml3% TCA洗研缽→5 000 rpm離心10 min→量上清液體積。

GSH的測(cè)定：上清液各2 ml（空白用3% TCA代替）→分別加入0.4 ml 1MNaOH→1 ml 2 mMDTNB→25℃5 min→測(cè)定A412。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同測(cè)定方法對(duì)種子發(fā)芽率的影響

兩種方法測(cè)得的小麥和玉米發(fā)芽率所得到得結(jié)果不同，TTC方法測(cè)得的小麥發(fā)芽率為94%，玉米發(fā)芽率為90%，而曙紅法測(cè)得的小麥發(fā)芽率為92%，玉米發(fā)芽率為86%。造成這種現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中人為地區(qū)分染色與未被染色的小麥存在誤差，也有可能是因?yàn)檠刂行木€對(duì)半切開時(shí)未將胚均勻分開。但就結(jié)果而言，小麥和玉米的發(fā)芽率都較高。

2.2 干旱脅迫下對(duì)脯氨酸（Pro）含量的影響

實(shí)驗(yàn)測(cè)得干旱脅迫下A520=1.927，計(jì)算得干旱脅迫下H202的含量為78.5 μmol/gFW，正常情況下A410=0.023，計(jì)算得正常情況下H202的含量為0.98 μmol/gFW。實(shí)驗(yàn)組脯氨酸含量高于對(duì)照組，約為80倍，說(shuō)明正常情況下小麥幼苗脯氨酸含量較低，但當(dāng)受到干旱脅迫時(shí)小麥幼苗的脯氨酸含量明顯增高，可以增加數(shù)十倍。

2.3 干旱脅迫下對(duì)丙二醛（MDA）含量的影響

實(shí)驗(yàn)測(cè)得干旱脅迫下A450=1.263，A532=0.192，計(jì)算得干旱脅迫下MDA的含量為0.208，正常情況下A450=0.077，A532=0.039，計(jì)算得正常情況下MDA的含量為0.531。實(shí)驗(yàn)組的MDA含量高于對(duì)照組，說(shuō)明干旱脅迫使得MDA含量升高。

2.4 干旱脅迫下對(duì)H2O2含量的影響

實(shí)驗(yàn)測(cè)得干旱脅迫下A410=0.752，計(jì)算得干旱脅迫下H202的含量為38.115 μmol/gFW，正常情況下A410=0.242，計(jì)算得正常情況下H202的含量為124.08 μmol/gFW。對(duì)照組H202的含量高于實(shí)驗(yàn)組，且干旱脅迫下的H202含量約是正常生長(zhǎng)的3.3倍，說(shuō)明干旱脅迫使得H202含量減少。

2.5 干旱脅迫下對(duì)過(guò)氧化酶活性的影響

實(shí)驗(yàn)測(cè)得干旱脅迫下30 s時(shí)A470=0.643，90 s 時(shí)A470=1.872，計(jì)算得干旱脅迫下POD含量為1.97 μmol/ gFWmin-1， 測(cè) 得 正 常 情 況 下 30 s時(shí) A470=0.258，90 s時(shí) A470=0.623，正常情況下POD含量為0.67 μmol/ gFWmin-1， 測(cè) 得 干 旱 脅 迫 下 30 s時(shí) A410=0.314，90 s A410=0.223， 正 常 情 況 下 30 s時(shí) A410=0.149，90 s A410=0.205，計(jì)算得干旱脅迫下PPO含量為127.4 U·g-1FW，正常情況下PPO含量為89.6 U·g-1FW，明顯的，干旱脅迫使過(guò)氧化酶含量升高。由下圖可知，實(shí)驗(yàn)組測(cè)得的POD含量和PPO含量都比對(duì)照組的含量高。最終可知，干旱脅迫使過(guò)氧化酶含量活性升高。

2.6 干旱脅迫下對(duì)GSH含量的影響

實(shí)驗(yàn)測(cè)得干旱脅迫下A412=1.503，計(jì)算得干旱脅迫下GSH的含量為8.2 665 μmol/gFW，正常情況下A412=0.113，計(jì)算得正常情況下GSH的含量為0.6 215 μmol/gFW。實(shí)驗(yàn)組測(cè)得的GSH含量明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明干旱脅迫使得GSH含量升高。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總于下圖可直觀看出干旱脅迫對(duì)小麥幼苗會(huì)產(chǎn)生一定影響。

圖1　干旱對(duì)過(guò)氧化酶活性的影響

圖2　干旱對(duì)小麥幼苗的影響

3 討論與分析

在干旱脅迫下，玉米小麥的發(fā)芽率會(huì)下降。且干旱脅迫下，小麥幼苗生長(zhǎng)受到一定抑制作用，生理生化指標(biāo)發(fā)生一系列變化，表現(xiàn)為干旱脅迫下，小麥幼苗胚芽鞘中脯氨酸、丙二醛（MDA）、H2O2、過(guò)氧化酶（POD、PPO）、谷胱甘肽（GSH）含量在干旱脅迫下含量較正常情況下的明顯升高。

植物活細(xì)胞的原生質(zhì)膜具有分別透性，使得染料分子曙紅不能透過(guò)，因而不能將具有生活力的種胚染色，而死的種胚，其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，通透性增大，于是曙紅便能透膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而將無(wú)生活力的種胚染色。

TTC是標(biāo)準(zhǔn)的氧化還原色素，溶于水后呈無(wú)色。當(dāng)TTC與種胚接觸時(shí)作為氫受體被還原型脫氫輔酶的氫還原，由無(wú)色TTC變成紅色的TTF。TTF顏色深淺與活力成正相關(guān)。

在受到輕度干旱脅迫時(shí)，植物能夠通過(guò)滲透調(diào)節(jié)降低水勢(shì)，保持膨壓。植物的滲透調(diào)節(jié)主要通過(guò)脯氨酸等親和性溶質(zhì)的積累而實(shí)現(xiàn)。脯氨酸等小分子有機(jī)物的大量積累不會(huì)破壞生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能，表現(xiàn)出良好的親和性，而且具有較強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)作用，因此，是理想的滲透物質(zhì)［3］。

在正常條件下，植物體內(nèi)游離脯氨酸的含量并不高，約占游離氨基酸總量的百分之幾。但當(dāng)植物處于干旱等逆境下時(shí)組織內(nèi)的游離脯氨酸水平明顯提高。這是因?yàn)橛捎诟彼岬姆肿咏Y(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)能夠保護(hù)酶的空間結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定膜系統(tǒng)，參與葉綠素合成，消除NH3的毒害，因而提高植物的抗性［4］。

植物器官在逆境下遭受傷害，往往發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂過(guò)氧化主要產(chǎn)物之一。一般認(rèn)為，MDA在植物體內(nèi)積累是活性氧毒害的表現(xiàn)，它的含量是判斷膜脂過(guò)氧化程度的一個(gè)重要指標(biāo)。干旱條件下，植物體內(nèi)隨干旱程度加重，MDA含量明顯增加［4］。

H2O2活性氧自由基是植物體內(nèi)破壞性很強(qiáng)的氧化物質(zhì)，干旱條件下它的積累可直接引起非酶促膜脂過(guò)氧化作用。氧化物質(zhì)含量的降低，其對(duì)植物細(xì)胞的破壞性也將下降，植物受傷害程度有可能減輕［5］。

植物在長(zhǎng)期進(jìn)化中已形成了清除活性氧自由基、抑制膜脂過(guò)氧化作用的酶促和非酶促系統(tǒng)，前者主要包括過(guò)氧化物酶（POD、PPO）等酶類，后者主要是谷胱甘肽（GSH）等小分子抗氧化物質(zhì)。一般認(rèn)為，干旱或其它逆境條件下，當(dāng)植物細(xì)胞自由基的產(chǎn)生和清除的平衡機(jī)制被破壞后，自由基積累，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的膜脂過(guò)氧化和脫脂化作用，造成膜系統(tǒng)損傷，使差向透性增大，引起代謝紊亂，嚴(yán)重時(shí)，植物遭受傷害［5］。

參考文獻(xiàn)

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*基金項(xiàng)目：云南師范大學(xué)2014年大學(xué)生科研訓(xùn)練基金項(xiàng)目（kkx2014-12-225）