李英夫,宣兆博,王　鶴,廉曉宇

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

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欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒子制備①

李英夫,宣兆博,王鶴,廉曉宇

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

摘要:目的：分析β-欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒子制備工藝的優(yōu)化。方法：把聚氰基丙烯酸正丁酯作為載藥材料，以包封率為考察標(biāo)準(zhǔn)，借助界面縮聚法，并通過正交試驗(yàn)和單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果：優(yōu)化后的制備工藝所獲得的欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒大小均勻、形態(tài)規(guī)則、無(wú)黏連，平均包封率為90.17%，平均粒徑為260nm。結(jié)論：該優(yōu)化方法切實(shí)可行，能有效提升欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的制備質(zhì)量。

關(guān)鍵詞:欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯；包封率；正交試驗(yàn)；納米粒

β-欖香烯是重要的抗癌單體，以抗癌中藥欖香烯揮發(fā)油作為生產(chǎn)原料，通過精餾純化等一系列工藝并去除δ、γ-欖香烯等成分獲得。應(yīng)用于癌癥治療中，具有很高的選擇性，且能增強(qiáng)免疫作用、無(wú)肝腎毒、骨髓抑制等優(yōu)勢(shì)，唯一的缺陷就是不良反應(yīng)較高[1,2]。為降低其不良反應(yīng)，并進(jìn)一步提高其肝癌治療的療效，本實(shí)驗(yàn)對(duì)藥物制備進(jìn)行了優(yōu)化，效果良好，現(xiàn)總結(jié)如下。

1儀器與試藥

1.1儀器

日本電子公式產(chǎn)JEOL JEM—1200EX 透射電鏡；高效液相色譜儀(Agilent 1100)；美國(guó) PSS 粒度分析儀公司產(chǎn)；Nicomp 380ZLS激光粒度儀；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(TGL—20M)；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(85—1 型)。

1.2試藥

β-欖香烯原料藥(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)從大連遠(yuǎn)大制藥有限公司購(gòu)得；β-欖香烯對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%)，從南京森貝伽生物科技有限公司購(gòu)得，批號(hào)為100268-200401；α-氰基丙烯酸正丁酯由浙江金鵬化工股份有限公司提供；泊洛沙姆 188EP標(biāo)準(zhǔn)品由法國(guó)蓋德化工產(chǎn)；右旋糖酐-70為北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)；試劑純度要求：乙腈(色譜純)，其余均為分析純。

2方法

2.1單因素試驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)均在固定投藥量15 mg、BCA75μL、油水比 1︰2、pH 3.0、Poloxamer 188(40mg)與 Dextran-70(40mg)條件下進(jìn)行[3]。(1)考察制備溫度，采用不同的制備溫度20℃、30℃、40℃，觀察其包封率結(jié)果無(wú)顯著變化，于是選擇室溫作為制備溫度；(2)考察制備時(shí)間，為提高包封率，在有機(jī)相與水相混合后常需要一段時(shí)間的攪拌，因此需考慮攪拌時(shí)間的影響。分別采用3、4、5h的攪拌時(shí)間觀察β-欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯的包封率，結(jié)果顯示不同攪拌時(shí)間包封率無(wú)顯著差異(P>0.05)?？梢姅嚢钑r(shí)間對(duì)其包封率無(wú)顯著影響，且3h所得包封率較高，攪拌時(shí)間設(shè)置為3h；(3)pH會(huì)對(duì)包封率和界面聚合速度同時(shí)產(chǎn)生影響，以室溫為制備溫度，3h攪拌時(shí)間，并分別以2.0、3.0、4.0進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示pH3.0時(shí)，聚合速度和包封率最為理想，故水相pH值設(shè)置為3.0；(4)考察表面活性劑用量，制備溫度為常溫、3h攪拌時(shí)間、水相pH為3.0，考察Dextran-70和 Poloxamer188分別為30、40、50mg的包封率，結(jié)果顯示50mg時(shí)最大為90.1%，故設(shè)置選擇兩種表面活性劑各50mg[4]。

2.2制備過程的優(yōu)化方法

(1)結(jié)合上述單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們知道最佳的制備溫度、攪拌時(shí)間、水相pH值和表面活性劑用量，現(xiàn)對(duì)投藥量、油水比、轉(zhuǎn)速和BCA用量的最佳組合方式進(jìn)行分析，依次設(shè)置A、B、C、D四個(gè)正交因子進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表選擇為L(zhǎng)9(34)[5]，對(duì)應(yīng)的因素水平見表1。

表1 因素水平

表2　正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果(n=3)

(2)常溫條件下，以BCA和β-欖香烯的丙酮溶液作為有機(jī)相，以Dextran-70和Poloxamer188各50mg用水溶解獲得水相，并用0.01mol/L標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液將水相pH精準(zhǔn)調(diào)節(jié)到3.0。通過一定轉(zhuǎn)速磁力攪拌作用，緩慢把有機(jī)相和水相按比例混合，3h的攪拌時(shí)間，隨后用NaOH溶液(0.01mol/L)調(diào)節(jié)pH值到7.0，攪拌0.5h用分液漏斗(G3)靜置，即可得β-欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯的膠體溶液。以表-1因素水平，并按表2中正交實(shí)驗(yàn)表完成實(shí)驗(yàn)，見表2。

2.3確定包封率測(cè)定方法

(1)色譜條件，室溫條件下，乙腈-水為(90:10)，體積流量設(shè)置為(1.0mL/min)，以 Diamonsil TM C18(5μm，150mm×4.6mm)為色譜柱，設(shè)置210nm的檢測(cè)波長(zhǎng)[6]。(2)線性關(guān)系考察，分別量取0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL的β-ELE 對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.896 mg/mL)，用甲醇稀釋后搖勻，分別精密吸取10μL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別在液相色譜儀下觀測(cè)其峰值面積，并以峰值面積為y軸坐標(biāo)，對(duì)照品的濃度為x軸坐標(biāo)，做線性回歸分析，并對(duì)回歸方程進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果顯示，β-欖香烯線性關(guān)系最好的濃度范圍是(22.4～179.2)μg/mL。(3)空白對(duì)照試驗(yàn)，按照上述優(yōu)化后的制備方法進(jìn)行操作，但制備過程中并不選擇加入β-欖香烯，從而制得空白納米粒，空白對(duì)照液的制備方法和供試品完全相同。分別精密吸取三種溶液10μL研究，分別為空白對(duì)照液、納米粒沉淀供試品溶液、納米粒對(duì)照品溶液，在相同的色譜條件下完成測(cè)量，測(cè)量結(jié)果顯示，在同等保留時(shí)間下的空白對(duì)照液并沒有出現(xiàn)峰值，因此排除其測(cè)定干擾[7]。(4)精密度實(shí)驗(yàn)，選擇低、中、高3中對(duì)照品溶液，在1d重復(fù)5次進(jìn)樣操作，計(jì)算1d內(nèi)的精密度變化，結(jié)果顯示其RSD分別為0.64%、0.79%、0.91%，隨后測(cè)量其日間精密度，每天進(jìn)樣一次，連續(xù)5d，測(cè)得RSD分別為0.82%、0.93%、1.82%。日間和日內(nèi)精密度均較好。(5)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，選擇同一樣品均分為5份，每間隔2h進(jìn)樣一次，分別測(cè)定其色譜峰面積，8h后所得RSD為1.27%，證明其在8h內(nèi)穩(wěn)定。(6)回收率實(shí)驗(yàn)，選擇已經(jīng)測(cè)定好的β-欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯膠體溶液，精密測(cè)取6份5mL溶液，轉(zhuǎn)入10mL容量瓶中，均精密加入適量的β-欖香烯對(duì)照品溶液1.0mL，嚴(yán)格按照相同的制備步驟以及色譜條件下獲得制品并進(jìn)樣，最后觀測(cè)并計(jì)算其回收率的均值。測(cè)得，β-欖香烯的回收率均值為96.7%，RSD則為1.7%，穩(wěn)定性良好。(7)包封率測(cè)定方法，綜合分析選擇低溫超速離心的方法，精密測(cè)取1mLβ-欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯膠體溶液，轉(zhuǎn)入離心管中，轉(zhuǎn)速設(shè)置為18000r/min，低溫4℃，離心時(shí)間1.5h，去掉上清液，用適量的流動(dòng)相將納米粒沉淀溶解，轉(zhuǎn)入10mL容量瓶，加流動(dòng)相滴準(zhǔn)，搖勻過濾，扔按上述色譜條件，獲取β-欖香烯實(shí)際藥物量(W1)。另精密測(cè)取1mLβ-欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯膠體溶液，轉(zhuǎn)入容量瓶(10mL)，加流動(dòng)相滴準(zhǔn)，搖勻?yàn)V過，與上述測(cè)定方法相同，測(cè)定藥物的總量(W0)，包封率計(jì)算方法為(W1/W0)，并對(duì)其進(jìn)行方差分析，見表3。

表3　方差分析

3結(jié)果

3.1工藝驗(yàn)證結(jié)果

為驗(yàn)證優(yōu)化后工藝質(zhì)量，按照上述正交實(shí)驗(yàn)所得的最佳工藝組合方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在同樣條件下分別制備3批β-欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯成品，測(cè)量其包封率，結(jié)果顯示3批成品包封率分別為90.2%、89.8%、90.3%，均值為90.1%，證明其工藝非常成熟。

3.2形態(tài)觀察和粒徑測(cè)定結(jié)果

按照上述所求最佳工藝制備條件制得β-欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯膠體溶液，將溶液稀釋并用磷鎢酸(1.5%)染色后采用透射電鏡對(duì)其形態(tài)進(jìn)行觀測(cè)，電鏡結(jié)果顯示，制品中納米粒大小均勻，有規(guī)整的形態(tài)，且無(wú)黏連。采用激光粒度分析儀測(cè)量其粒徑均值，結(jié)果粒徑均值為260nm。

4討論

在制藥工藝中，納米粒形態(tài)的藥物制備方法主要有界面縮聚法和乳化聚合法，由于β-欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯的原料藥為β-欖香烯，其為一種揮發(fā)性強(qiáng)的脂溶性油類，因此不宜選擇乳化聚合法。常規(guī)的方法是將BCA和β-欖香烯溶解在有機(jī)溶劑中，并作為油相與水相緩慢混合，音α-BCA中含有βC+，因此可與水中的OH-離子發(fā)生聚合反應(yīng)，從而包裹β-欖香烯獲得納米粒。為包封率的影響因素主要為聚合反應(yīng)速度、pH值、油水比例等。本文結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)其制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，結(jié)果顯示優(yōu)化后的制備方法實(shí)際可行，制得納米粒均勻、平整，且粒徑滿足要求。

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基金項(xiàng)目：①黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目，編號(hào)：H201369。

作者簡(jiǎn)介：李英夫(1979～)男，黑龍江明水人，碩士，主治醫(yī)師。

中圖分類號(hào)：R284

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0104(2016)03-0100-02

(收稿日期：2016-03-07)