王雪成,葛　欣,劉振平

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003;2.黑龍江省醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150086)

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結(jié)直腸癌對腸壁神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)學(xué)的影響①

王雪成1,葛欣2,劉振平1

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003;2.黑龍江省醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150086)

摘要：目的:觀察結(jié)直腸癌對腸壁神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)學(xué)的影響。方法：收集2014～2015年的T3～T4期結(jié)直腸癌組織40例，正常組織10例。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法與病理顯微鏡圖像分析軟件，檢測結(jié)直腸癌組中黏膜下神經(jīng)淺叢、深叢及肌間神經(jīng)叢的陽性染色區(qū)域的平均吸光度并與正常組進(jìn)行對比。結(jié)果：結(jié)直腸癌組中神經(jīng)排列紊亂、直徑變細(xì)，甚至神經(jīng)元及神經(jīng)纖維的消失，而正常組中神經(jīng)形態(tài)規(guī)則，排列整齊，分布均勻。正常組中黏膜下神經(jīng)淺叢的平均吸光度(0.20±0.07)、深叢的平均吸光度(0.16±0.08)及肌間神經(jīng)叢的平均吸光度(0.21±0.06)，明顯高于結(jié)直腸癌組中黏膜下神經(jīng)淺叢的平均吸光度(0.12±0.03)、深叢的平均吸光度(0.11±0.04)及肌間神經(jīng)叢的平均吸光度(0.16±0.05)，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：結(jié)直腸癌對腸壁神經(jīng)系統(tǒng)的破壞，可能是引起患者臨床癥狀的一個原因。

關(guān)鍵詞：結(jié)直腸癌；腸神經(jīng)系統(tǒng)；免疫組織化學(xué)

結(jié)直腸癌的發(fā)病率占我國惡性腫瘤的第4位[1]。大部分的結(jié)直腸癌起源于腺瘤，腺瘤惡變后依次侵犯黏膜下層、肌層直至漿膜層。在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的過程中會逐漸破壞腸道的腸壁神經(jīng)系統(tǒng)。有學(xué)者提出[2]，結(jié)直腸癌患者排便習(xí)慣和規(guī)律的變化,可能與癌細(xì)胞對腸壁神經(jīng)系統(tǒng)的破壞相關(guān)。然而，關(guān)于結(jié)直腸癌患者腸壁神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)學(xué)改變的相關(guān)研究還比較缺乏，為此，我們應(yīng)用蛋白基因產(chǎn)物9.5(Protein Gene Product 9.5，PGP9.5)作為神經(jīng)的標(biāo)記物，分別檢測正常組與結(jié)直腸癌組中黏膜下神經(jīng)淺叢、深叢及肌間神經(jīng)叢的陽性染色區(qū)域的平均吸光度，探討結(jié)直腸癌對腸壁神經(jīng)系統(tǒng)的影響。

1資料和方法

1.1一般資料

收集黑龍江省醫(yī)院2014-01～2015-06，手術(shù)切除的T3～T4期結(jié)直腸癌組織40例為結(jié)直腸癌組(左半結(jié)腸癌13例，橫結(jié)腸癌6例，右半結(jié)腸癌4例，乙狀結(jié)腸癌13例，直腸癌4例)，其中男25例，女15例，年齡37～83歲，切除標(biāo)本經(jīng)病理檢查，證實為T3～T4期結(jié)直腸癌。取距離手術(shù)切緣5cm以上的正常結(jié)直腸組織10例為正常組(左半結(jié)腸癌2例，橫結(jié)腸癌1例，右半結(jié)腸癌4例，乙狀結(jié)腸癌1例，直腸癌2例)，其中男6例、女4例，年齡39～50歲，術(shù)后病理證實為正常組織。所有標(biāo)本均應(yīng)包括腸道全層，病人術(shù)前均未接受過放化療，也無其它嚴(yán)重性疾病。

1.2方法

所有標(biāo)本經(jīng)中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、包埋、切片10微米、切片常規(guī)脫蠟，抗原熱修復(fù)，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS緩沖液沖洗封閉，加一抗PGP9.5(購自北京中杉金橋，ZA-0263)，PBS緩沖液沖洗，滴加二抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。

1.3免疫組化染色判讀

用德國萊卡公司生產(chǎn)的顯微鏡觀察切片，在低倍鏡(×100)下分別觀察，黏膜下神經(jīng)淺叢、深叢及肌間神經(jīng)的陽性表達(dá)情況，再轉(zhuǎn)換成高倍鏡(×400)，每個神經(jīng)叢區(qū)域隨機選取5個不重疊高倍視野，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量積分吸光度和陽性染色區(qū)域的面積，計算單位面積染色區(qū)域平均吸光度。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌組與正常組中腸壁神經(jīng)系統(tǒng)的形態(tài)

PGP 9.5廣泛分布于腸壁神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元及神經(jīng)纖維。在正常組中可以觀察到PGP 9.5陽性表達(dá)的三條神經(jīng)叢，分別為走行于黏膜固有層的黏膜下神經(jīng)淺叢，走行于黏膜肌層的黏膜下神經(jīng)深叢和走行于環(huán)形與縱行肌之間的肌間神經(jīng)叢。在正常組中，PGP 9.5陽性表達(dá)的黏膜下神經(jīng)淺叢、深叢及肌間神經(jīng)叢的形態(tài)規(guī)則，排列整齊，分布均勻，見圖1。在結(jié)直腸癌組中，可以看到癌細(xì)胞改變了正常神經(jīng)叢的走向，使神經(jīng)叢排列更加紊亂、進(jìn)一步扭曲，直徑變得更細(xì)，甚至神經(jīng)元及神經(jīng)纖維的消失，見圖2。

圖1PGP 9.5免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)叢(×100)圖1A:正常組；1B:結(jié)直腸癌組；圖中a:黏膜下神經(jīng)淺叢；b：黏膜下神經(jīng)深叢；c：肌間神經(jīng)叢

2.2結(jié)直腸癌組與正常組中各神經(jīng)叢平均吸光度的比較

正常組中黏膜下神經(jīng)淺叢的平均吸光度(0.20

±0.07)、深叢(0.16±0.08)及肌間神經(jīng)叢的平均吸光度(0.21±0.06)，明顯高于結(jié)直腸癌組中的黏膜下神經(jīng)淺叢的平均吸光度(0.12±0.03)、深叢(0.11±0.04)及肌間神經(jīng)叢的平均吸光度(0.16±0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1　結(jié)直腸癌組和正常組中黏膜下神經(jīng)淺叢、深叢、肌間神經(jīng)叢的平均吸光度表達(dá)±s)

圖2　正常組PGP 9.5免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)叢(×200)　2A：黏膜下神經(jīng)淺叢；2B：黏膜下神經(jīng)深叢；2C：肌間神經(jīng)叢

圖3　結(jié)直腸癌組PGP 9.5免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)叢(×200)　3A：黏膜下神經(jīng)淺叢；3B：黏膜下神經(jīng)深叢；3C：肌間神經(jīng)叢

3討論

結(jié)直腸癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一[3]。目前的研究絕大部分關(guān)注于腫瘤患者的預(yù)防和治療上，而關(guān)于其腸道功能的研究鮮有報道。腸壁神經(jīng)系統(tǒng)是腸道特有的外周神經(jīng)系統(tǒng)，其神經(jīng)元和神經(jīng)纖維組成完整的神經(jīng)反射弧，可以不依賴中樞神經(jīng)系統(tǒng)自主的發(fā)揮各種功能。在結(jié)直腸癌患者中，癌細(xì)胞無疑會破壞腸壁神經(jīng)系統(tǒng)，引起腸壁神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)和功能的變化。我們的研究顯示，癌細(xì)胞侵犯的腸壁，會出現(xiàn)神經(jīng)叢排列紊亂和扭曲，直徑變細(xì)，甚至神經(jīng)元及神經(jīng)纖維的消失的現(xiàn)象。以及局部區(qū)域神經(jīng)纖維的吸光度在癌組織中明顯較正常組織減低。

PGP9.5廣泛分布于中樞與外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元、神經(jīng)纖維以及各種神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，與傳統(tǒng)神經(jīng)染色相比，PGP9.5具有操作簡單，價格低廉，清晰等優(yōu)勢。在國外PGP9.5已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于癌組織中神經(jīng)的標(biāo)記，如前列腺癌[4,5]、結(jié)直腸癌[6]、鱗癌[7]及外周神經(jīng)腫瘤[8]，而國內(nèi)僅有PGP9.5用于乳腺癌中[9]神經(jīng)標(biāo)記的報導(dǎo)。因此，我們選用PGP9.5標(biāo)記結(jié)直腸癌組和正常組中的腸壁神經(jīng)系統(tǒng)。我們的結(jié)果表明PGP9.5能良好的顯示神經(jīng)叢的形態(tài)，是觀測腸壁神經(jīng)系統(tǒng)良好的指標(biāo)。已經(jīng)有研究證實平均吸光度是能夠準(zhǔn)確反映物質(zhì)含量的指標(biāo)，因此我們選用這個指標(biāo)來證實結(jié)直腸癌對腸壁神經(jīng)系統(tǒng)的破壞。由于腸壁神經(jīng)系統(tǒng)中各神經(jīng)叢對腸道的作用不同，所以我們分別對比正常組與癌組中，黏膜下神經(jīng)淺叢、深叢及肌間神經(jīng)叢的平均吸光度的變化，來推測不同神經(jīng)叢的破壞所導(dǎo)致患者出現(xiàn)的癥狀。

我們的研究顯示，結(jié)直腸癌引起黏膜下及肌間神經(jīng)叢的平均吸光度均明顯減低(P<0.05)。分析原因可能是由于，結(jié)直腸癌在發(fā)展的過程中會逐漸破壞腸道的粘膜下及肌間神經(jīng)叢，使各神經(jīng)叢發(fā)生斷裂，直徑變細(xì)，甚至神經(jīng)元及神經(jīng)纖維的消失。Godlewski[2]的研究成果似乎也可以證明這個原因，結(jié)直腸癌組織侵犯到黏膜下層時，引起黏膜下神經(jīng)叢位置發(fā)生改變，甚至神經(jīng)元及神經(jīng)纖維的消失。當(dāng)癌組織侵犯到肌層時，就會破壞肌間神經(jīng)叢的正常形態(tài)，使肌間神經(jīng)叢變形、結(jié)構(gòu)破壞甚至消失。我們的實驗僅用了PGP9.5對腸壁神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)記，還有關(guān)于PGP9.5和神經(jīng)遞質(zhì)抗體雙標(biāo)記的報導(dǎo)[10,11]，研究顯示結(jié)直腸癌侵犯黏膜下及肌間神經(jīng)叢時，分泌降鈣素基因相關(guān)肽與神經(jīng)肽Y的神經(jīng)元數(shù)目及神經(jīng)纖維密度均明顯減低，而分泌P物質(zhì)與垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽的神經(jīng)纖維密度明顯減低。降鈣素基因肽、神經(jīng)肽Y、垂體腺苷酸環(huán)化酶均為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，這些神經(jīng)遞質(zhì)的減少可能引起結(jié)直腸癌患者腹瀉的癥狀。P物質(zhì)為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的代表，它的減低可能引起結(jié)直腸癌患者便秘的癥狀。

然而，也有不同的報道，Sitohy[12]等人的研究顯示，結(jié)腸癌大鼠的黏膜下及肌間神經(jīng)叢的相對密度明顯比正常組增高(P<0.05)。Liebl等人[13]檢測神經(jīng)軸突的密度，發(fā)現(xiàn)直腸癌細(xì)胞能刺激神經(jīng)的再生，結(jié)腸癌細(xì)胞中缺少神經(jīng)生長因子、生長相關(guān)蛋白-43及神經(jīng)營養(yǎng)因子抗體,而沒有發(fā)現(xiàn)神經(jīng)再生現(xiàn)象。Albo[14]等人，將游離的背根神經(jīng)和結(jié)腸癌細(xì)胞(KM12)共同培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種背根神經(jīng)神經(jīng)比不加入結(jié)腸癌細(xì)胞的背根神經(jīng)出現(xiàn)明顯的神經(jīng)再生。這些結(jié)論與我們研究成果可能是矛盾的，一方面可能是由于Basel選擇的標(biāo)本與我們標(biāo)本的種屬差異。另一方面Liebl與Albo等人均是選擇離體培養(yǎng)癌細(xì)胞，與我們選擇的標(biāo)本不同。Albo[14]等人還檢測了236例結(jié)直腸癌病人標(biāo)本，其中在63%的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)有不同程度的神經(jīng)再生。雖然Albo也選用了結(jié)直腸癌病人的標(biāo)本，但缺少標(biāo)本分期的具體信息。而我們實驗選擇的標(biāo)本均為T3～T4期結(jié)直腸癌標(biāo)本，這些癌細(xì)胞破壞能力更強，可能將新生的神經(jīng)也都破壞掉了。新的研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤中有神經(jīng)再生的現(xiàn)象，通過前面文章的報導(dǎo)也可以證明了這一觀點。我們在閱片時也曾發(fā)現(xiàn)1例，直腸癌組織的肌間神經(jīng)叢直徑比正常組明顯增粗。所以我們分析，可能使當(dāng)結(jié)直腸癌侵犯到黏膜下或黏膜肌層時破壞了黏膜下神經(jīng)叢，機體應(yīng)激性產(chǎn)生一些神經(jīng)生長因子，刺激與黏膜下神經(jīng)叢相互聯(lián)絡(luò)的肌間神經(jīng)叢出現(xiàn)再生的現(xiàn)象。所以我們下一步準(zhǔn)備選取T1～T2期的結(jié)直腸癌標(biāo)本，觀察結(jié)直腸癌組中肌間神經(jīng)叢的變化情況。

腸壁神經(jīng)系統(tǒng)是腸道特有的外周神經(jīng)系統(tǒng)，其興奮性和抑制性神經(jīng)元存在精細(xì)而又復(fù)雜的平衡關(guān)系。結(jié)直腸癌在發(fā)生、發(fā)展的過程中，會逐漸破壞腸壁神經(jīng)系統(tǒng)中的興奮性與制性神經(jīng)元。當(dāng)興奮性神經(jīng)元占優(yōu)勢時，患者可能出現(xiàn)腹瀉的癥狀。相反，抑制性神經(jīng)元占優(yōu)勢時，患者可能出現(xiàn)便秘的癥狀。因此，我們可以推斷結(jié)直腸癌對腸壁神經(jīng)系統(tǒng)的破壞，可以解釋患者出現(xiàn)的臨床癥狀，但這只是其中的一個原因。

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基金項目：①佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新課題，編號：LM2015_027。

作者簡介：王雪成(1989～)男，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。 通訊作者：葛欣(1970～)男，黑龍江哈爾濱人，博士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：gexincom@163.com。

中圖分類號：R735.3+7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號：1008-0104(2016)03-0037-03

(收稿日期：2016-02-18)