于海蓮，周一莎，程秀華，秦迎春

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003;2.雙鴨山市人民醫(yī)院耳鼻喉科，黑龍江 雙鴨山 155100)

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RECK在膽脂瘤型中耳炎中的表達(dá)①

于海蓮1，周一莎2，程秀華1，秦迎春1

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003;2.雙鴨山市人民醫(yī)院耳鼻喉科，黑龍江 雙鴨山 155100)

摘要：目的：研究基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑RECK (reversion-inducing -cysteine- rich protein with Kazal motifs，RECK)在膽脂瘤型中耳炎上皮和正常外耳道上皮中的表達(dá)特點(diǎn)及意義，并探討 RECK對(duì)膽脂瘤型中耳炎侵襲能力的影響。方法:采用免疫組織化學(xué)染色法(SP法)檢測(cè)31例膽脂瘤型中耳炎上皮和23例正常外耳道上皮中RECK的表達(dá)。結(jié)果:31例膽脂瘤上皮組織樣本中，有14例(45.16%)標(biāo)本檢測(cè)到RECK的陽性表達(dá)；23例外耳道上皮組織樣本中有21例(91.30%)檢測(cè)到RECK的陽性表達(dá)，且兩組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。結(jié)論:RECK在膽脂瘤型中耳炎上皮組織中低表達(dá)，在外耳道上皮組織中高表達(dá)，預(yù)示此因子參與中耳膽脂瘤的發(fā)病過程及在病情進(jìn)展中起到負(fù)調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞：膽脂瘤；中耳炎；RECK; 免疫組織化學(xué)

膽脂瘤型中耳炎(cholesteatoma of middle ear)是耳鼻咽喉科常見的疾病，是一種位于中耳乳突腔內(nèi)的囊性結(jié)構(gòu)，而非真性腫瘤，臨床發(fā)現(xiàn)，膽脂瘤型中耳炎具有類似于惡性腫瘤的生物學(xué)特征，如破壞性、侵襲性、遷移性、異常調(diào)控增殖性、復(fù)發(fā)性等，但本病在病理上屬于良性病變，而非惡性腫瘤[1]。這些特性能使其導(dǎo)致不同程度的骨質(zhì)破壞，從而引起不同程度的聽力損失，甚至引發(fā)前庭功能障礙及面神經(jīng)麻痹一系列病癥，使患者的生命安全受到嚴(yán)重威脅?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑 RECK(reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs， RECK)是Takahashi發(fā)現(xiàn)的一種新型轉(zhuǎn)移抑制基因，它的表達(dá)與腫瘤的侵潤(rùn)及轉(zhuǎn)移、新生血管的形成都有著密切關(guān)系。近年來，圍繞RECK與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移這一主題，先后有肝癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌等相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。有文獻(xiàn)報(bào)道[2]，RECK的表達(dá)量在腫瘤侵襲能力的強(qiáng)弱及患者預(yù)后等方面都呈負(fù)相關(guān)性。RECK對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、侵潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等過程，可能是通過負(fù)性調(diào)控MMP-2、9及控制模型基質(zhì)金屬蛋白酶-1的分泌來完成的。同時(shí)其抑制腫瘤血管生成的作用也可抑制腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。RECK作為一種基質(zhì)金屬蛋白酶抑制基因，已被證實(shí)能通過下調(diào)MMPs的表達(dá)及影響腫瘤血管的新生，來抑制多種腫瘤的生物學(xué)特性，進(jìn)而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲[3]。本文采用免疫組織化學(xué)方法來檢測(cè)RECK在膽脂瘤型中耳炎上皮中的分布及表達(dá)水平，根據(jù)結(jié)果進(jìn)一步探討在膽脂瘤上皮增殖中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料

①實(shí)驗(yàn)組：31例膽脂瘤型中耳炎上皮組織，標(biāo)本均來自于佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科2013-04～2014-10住院手術(shù)的中耳膽脂瘤患者。其中男17例，女14例；年齡25～69歲，平均48.5歲。②對(duì)照組：23例正常外耳道上皮組織，標(biāo)本均來自于佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科2013-04～2014-10住院行乳突根治術(shù)患者的正常外耳道上皮組織。男12例，女11例；年齡38～80歲，平均55.8歲。

1.2試劑

鼠抗人RECK多克隆抗體,SP試劑盒等均購自上海越研生物科技有限公司。

1.3方法

所有標(biāo)本均經(jīng)過甲醛固定，再用酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。經(jīng)過HE染色并明確病理診斷，切片厚度取4～5μm。RECK應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)。將石蠟切片、脫蠟、水化，后用3%H2O2室溫孵育10～20min，PBS 沖3min×3；經(jīng)胰酶消化后37℃孵育箱25min，用PBS沖洗5min×3；再滴入血清室溫孵育5min，用PBS 沖洗；加1抗MMP-14，經(jīng)4℃過夜，PBS沖洗5min×3;滴入生物素標(biāo)記的2抗，再經(jīng)室溫孵育、PBS沖洗；滴加過氧化物親和素酶溶液， 孵育、沖洗；滴加DAB顯色液，鏡下觀測(cè)并控制顯色時(shí)間；經(jīng)自來水清洗后用蘇木復(fù)染、脫水、透明、封片。用已知陽性對(duì)照片作為陽性對(duì)照，用PBS 代替1抗作為陰性對(duì)照。

2結(jié)果判定

所有切片均采用雙盲法進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)，避開組織切片的邊緣，選擇顏色明顯強(qiáng)于背景著色處計(jì)數(shù)。每張病理切片至少在高倍顯微鏡(200×)下觀察10個(gè)以上不重復(fù)的視野，繼而判斷細(xì)胞染色強(qiáng)度和細(xì)胞染色百分率為記分方式[4]，得到判斷結(jié)果如下：

(1)細(xì)胞染色強(qiáng)度(分)：0分：未染色；1分：弱染色；2分：中等強(qiáng)度染色；3分：強(qiáng)度染色。(2)細(xì)胞染色百分率(分)：0分 ：0%陽性細(xì)胞；1分：≤25%陽性細(xì)胞；2分：25%～50%陽性細(xì)胞；3分：>50%陽性細(xì)胞。兩項(xiàng)計(jì)分相加后分成4級(jí)，判斷標(biāo)準(zhǔn)為：0分(-)；1～2分(+)；3～4分()；5～6分()。其中"-"示為陰性表達(dá)，"+"示為陽性表達(dá)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，陽性率的比較采用χ2檢驗(yàn)，兩兩比較采用Spearman相關(guān)性分析，兩者均以P<0.05作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4結(jié)果

4.1RECK在正常外耳道上皮組織及膽脂瘤上皮組織中的表達(dá)情況，見表1。

4.2RECK在正常組織中有廣泛的表達(dá)，陽性信號(hào)表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色、黃色、棕黃色顆粒。在中耳膽脂瘤組織中的表達(dá):31例中耳膽脂瘤上皮中陽性表達(dá)為14例，陽性表達(dá)率為45.16%(14/31),見圖1；在外耳道上皮組織中表達(dá)較高，多位于細(xì)胞漿，呈棕黃色或棕褐色顆粒，23例中陽性表達(dá)為21例，陽性表達(dá)率為91.30%(21/23),見圖2。RECK在膽脂瘤中的表達(dá)明顯低于正常外耳道上皮中，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.973，P<0.05)。

圖1　RECK在膽脂瘤組織中陰性表達(dá)(SP×200)

圖2　RECKA在外耳道上皮中陽性表達(dá)(SP×200)

RECK-+總例數(shù)陽性率(%)中耳膽脂瘤組1795031(14)45.16外耳道上皮組2251423(21)91.3

注：χ2=6.973 ，P<0.05。

5討論

RECK基因是長(zhǎng)約87kb，定位在染色體9p13-p12上的一種抑癌基因，它具有獨(dú)特的抑制MMPs活性與表達(dá)的功能。由日本學(xué)者 Takahashi等在1998年的v-Ki-ras轉(zhuǎn)染小鼠纖維原細(xì)胞株NIH3T3中發(fā)現(xiàn)的[5]。許多研究證實(shí)，RECK基因起著負(fù)向調(diào)控許多癌基因的作用。研究表明[6]，許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與RECK基因定位的區(qū)域密切相關(guān)。新生血管給腫瘤的持續(xù)增長(zhǎng)提供了氧分和能量，MMPs的高度表達(dá)能夠促進(jìn)血管形成，它是通過過度降解ECM來實(shí)現(xiàn)的。RECK高表達(dá)時(shí)，能夠抑制MMPs的表達(dá)，進(jìn)而抑制血管的形成，RECK對(duì)于MMPs的這種調(diào)節(jié)關(guān)系，在腫瘤血管形成中十分重要。許多研究已經(jīng)證實(shí)[7]RECK在腫瘤中的表達(dá)強(qiáng)度與其內(nèi)部血管的多少呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，RECK作為一種基質(zhì)金屬蛋白酶抑制基因，已被證實(shí)能通過下調(diào)MMPs的表達(dá)及影響腫瘤血管的新生，來抑制多種腫瘤的生物學(xué)特性，進(jìn)而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲。目前的研究己經(jīng)回答了許多問題，但是有很多的問題還有待解決。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化 SP法，檢測(cè) RECK在膽脂瘤型中耳炎上皮組織中及正常外耳道上皮組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RECK在正常組織中有廣泛的表達(dá)，陽性信號(hào)表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色、黃色、 棕黃色顆粒狀。在膽脂瘤型中耳炎上皮組織中的表達(dá)，31例膽脂瘤上皮組織中陽性表達(dá)為14例，陽性表達(dá)率為45.16%；在外耳道上皮組織中表達(dá)較高，多位于細(xì)胞漿，呈棕黃色或棕褐色顆粒，23例中陽性表達(dá)為21例，陽性表達(dá)率為91.30%；RECK在膽脂瘤中的表達(dá)明顯低于正常外耳道上皮中，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.973，P<0.05)。以上結(jié)果可能預(yù)示了RECK的表達(dá)缺失或降低在膽脂瘤型中耳炎的生成與發(fā)展的過程中起著重要作用?？赡軐?duì)膽脂瘤型中耳炎的生成與發(fā)展有著抑制的作用，其低表達(dá)可能引起膽脂瘤發(fā)病幾率增高。

RECK在膽脂瘤型中耳炎上皮組織中低表達(dá)，在外耳道上皮組織中高表達(dá)，可能說明此因子參與膽脂瘤型中耳炎的發(fā)病過程及在病情進(jìn)展中起到負(fù)調(diào)節(jié)作用。

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基金項(xiàng)目:黑龍江省自然科學(xué)基金，編號(hào):QC2010076。

作者簡(jiǎn)介：于海蓮(1966～)女，黑龍江佳木斯人，本科，副主任護(hù)師。 通訊作者:秦迎春 (1968～) 女，黑龍江佳木斯人，本科，副主任護(hù)師。E-mail:milk821053941@163.com。

中圖分類號(hào)：R764.21

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0104(2016)03-0013-02

(收稿日期：2015-12-02)