楊東紅，付　爽，馮卉姍，侯玉澤，趙　剛， 葉之慧，吳立鵬

(佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002)

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機械力加載IGF-I轉(zhuǎn)染PDL細(xì)胞對α輔肌動蛋白影響的研究①

楊東紅，付爽，馮卉姍，侯玉澤，趙剛， 葉之慧，吳立鵬

(佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002)

摘要：目的：觀察IGF-I轉(zhuǎn)染對應(yīng)力作用下牙周膜成纖維細(xì)胞α輔肌動蛋白mRNA表達(dá)水平的影響。方法：應(yīng)用外源性IGF-I轉(zhuǎn)染人牙周膜成纖維細(xì)胞，使用四點彎曲加力裝置對轉(zhuǎn)染組和為轉(zhuǎn)染組細(xì)胞加力，RT-PCR檢測不同加力時間點各組細(xì)胞的α輔肌動蛋白基因表達(dá)變化。結(jié)果：在機械力刺激下IGF-I轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的α輔肌動蛋白mRNA表達(dá)量隨著加力時間延長明顯上調(diào)，且轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：IGF-I轉(zhuǎn)染對機械力加載狀態(tài)下人牙周膜成纖維細(xì)胞的α輔肌動蛋白有較強的調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：牙周膜成纖維細(xì)胞；α輔肌動蛋白；轉(zhuǎn)染；IGF-I

正畸牙齒移動是在力學(xué)信號的作用下，牙周組織發(fā)生生理限度內(nèi)的組織改建，使牙齒向預(yù)定的方向移動[1.2]。在正畸過程中，力學(xué)信號傳遞到牙周膜成纖維細(xì)胞骨架，使其發(fā)生形態(tài)和結(jié)構(gòu)上的改變，導(dǎo)致與細(xì)胞骨架相關(guān)聯(lián)的化學(xué)信號傳遞通道產(chǎn)生變化，把力學(xué)信號轉(zhuǎn)變成細(xì)胞能理解和執(zhí)行的化學(xué)信號，進(jìn)而使牙周膜細(xì)胞為了適應(yīng)力學(xué)環(huán)境的變化基質(zhì)代謝發(fā)生改變[3.4]。細(xì)胞骨架由微絲、微管和中間纖維構(gòu)成，微絲的基本成分是肌動蛋白(actin)，它的變化可以反映出細(xì)胞骨架的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化[5,6]。本實驗通過轉(zhuǎn)染外源IGF-I基因進(jìn)入離題培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞，研究力學(xué)信號刺激引起離體培養(yǎng)細(xì)胞力學(xué)模型的肌動蛋白mRNA變化情況，進(jìn)而探討PDL細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)和形態(tài)改變，為深入研究正畸牙周組織改建機制打下堅實的基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1主要試劑和儀器

Lipotap脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，Total RNA Extractor (Trizol)試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)和M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(上海生工生物工程股份有限公司)，超凈工作臺(Spegair，美國)，F(xiàn)orcel四點彎曲細(xì)胞力學(xué)加載儀(四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院正畸科和電子科技大學(xué)聯(lián)合研 制)，CO2恒溫培育箱(Sanyo，日本),分光光度計(UV-2401PC，上海)，倒置顯微鏡及照相機系統(tǒng)(Olympus,日本)。

1.2人牙周膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定和轉(zhuǎn)染

經(jīng)患者和(或)其家長同意，取11～16歲青少年因正畸治療拔除的健康雙尖牙，用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)，常規(guī)傳代培養(yǎng)。取第2代細(xì)胞爬片，用免疫組化SP法進(jìn)行波形絲蛋白和細(xì)胞角蛋白染色，證明其為中胚層來源的成纖維細(xì)胞，取第 4～6代的細(xì)胞作為研究對象。取6孔培養(yǎng)板，向每孔中加入2mL含2×105個PDL細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃ CO2培養(yǎng)至60%匯合用2mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入1mL不含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，加入IGF-錯誤！未找到引用源。目的基因和脂質(zhì)體混合物，搖勻，37℃溫箱置24h，吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液孵育PDL細(xì)胞，完成轉(zhuǎn)染。用G418培養(yǎng)液對轉(zhuǎn)染IGF-I基因的細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)IGF-I基因的人牙周膜成纖維細(xì)胞株。

1.3實驗分組及HPDLF力學(xué)模型構(gòu)建

經(jīng)IGF-I轉(zhuǎn)染的HPDLF為實驗組，正常HPDLF設(shè)為對照組，各組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，以1.0×109L-1密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中1/3，37℃恒溫培養(yǎng)。在細(xì)胞加力前，將原培養(yǎng)基換成分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h(37℃、飽和濕度、95%空氣、5%CO2培養(yǎng)箱中同步化孵育)，將接種在加力板上的各組細(xì)胞置于Forecl四點彎曲力學(xué)加載儀施加動態(tài)張力(2000u strain，頻率0.5Hz，位移1mm)，實驗組和對照組均設(shè)立加力3h、6h、12h、24h組和未加力組，每個實驗組包含3個實驗樣本，各組重復(fù)3次。

1.4RT-PCR檢測牙周膜成纖維細(xì)胞α-肌動蛋白表達(dá)

在各組細(xì)胞的加力板上每10cm2面積加入1mL Trizol液裂解細(xì)胞，按照Total RNA Extractor試劑盒要求提取細(xì)胞總RNA，電泳檢測 RNA 是否降解，紫外分光光度計測量 RNA 濃度和純度。利用 M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶，將提取的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，加入α-actin上游引物：5＇-GGCCGAGATCTCACCGACTACC-3＇，下游引物：5＇-AGCCGCCGATCCAGACAGAATA-3＇(引物由上海生工公司設(shè)計合成)，在95℃ 10min，95℃ 15s，58℃ 60s， 40個循環(huán)的條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR，其上游引物：5＇-GGCAGCCCAGAACATCATCC-3＇，下游引物：5＇-GCCAGCCCCAGCATCAAAG-3＇(引物由上海生工公司設(shè)計合成)，反應(yīng)結(jié)束后取產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,凝膠圖像分析系統(tǒng)軟件掃描圖像并測定各電泳條帶相對積分光密度值。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件單因素方差分析，依據(jù)α-actin和內(nèi)參GAPDH的電泳圖，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)軟件掃描圖像并測定各電泳條的灰度值，每一次條帶測量3次，將目的基因與內(nèi)參的灰度值相比計算相對積分光密度值，以P<0.05為檢驗水平。

2結(jié)果

2.1人牙周膜成纖維細(xì)胞生長觀察及鑒定

人牙周膜組織原代細(xì)胞7d左右從組織塊向四周放射狀游出，顯微鏡下見細(xì)胞多呈長梭形、胞體豐滿、胞漿均勻、胞核圓、核仁清晰。細(xì)胞傳代后貼壁生長、性狀穩(wěn)定、狀態(tài)良好，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測細(xì)胞呈抗角蛋白陰性、抗波形絲蛋白陽性，具有中胚層來源的成纖維細(xì)胞特性。

2.2細(xì)胞的篩選

轉(zhuǎn)染IGF-I基因后牙周膜成纖維細(xì)胞胞漿內(nèi)有細(xì)小的深棕色顆粒沉積，繼續(xù)培養(yǎng)72h，待細(xì)胞生長接近融合時傳代，傳代后的細(xì)胞培養(yǎng)至50%～70%融合時更換濃度為800μg/mL的G418培養(yǎng)液篩選(以未轉(zhuǎn)染的 PDLC細(xì)胞做對照)。細(xì)胞培養(yǎng)4d后，對照組細(xì)胞完全死亡，而轉(zhuǎn)染組仍有生長良好的，將G418濃度降低到200μg/mL繼續(xù)篩選至2周，此時仍生長良好的細(xì)胞即認(rèn)定為是穩(wěn)定表達(dá)IGF-I基因的人牙周膜成纖維細(xì)胞株，可用以下一步實驗。

2.3周期性應(yīng)力對α輔激動蛋白mRNA表達(dá)的影響

見表1。

表1　α輔肌動蛋白 mRNA的OD比值

△表示不同實驗組內(nèi)各加力時間點與未加力組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，*表示不同加力時間點兩實驗組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

如表1所示，在應(yīng)力作用下α-肌動蛋白mRNA的OD值與對照組比較均有所增加，各加力時間點與對照組比較差異都有顯著性差異，且隨著加力時間的延長α-actin mRNA表達(dá)量呈上調(diào)趨勢。在同一實驗組內(nèi)加力6h與3h比較、加力12h與6h比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，加力24h與12h比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組比較，各加力時間點α-actin mRNA表達(dá)均有顯著性差異。

3討論

牙周膜細(xì)胞(periodontal ligament cell， PDLC)是牙周組織最主要的細(xì)胞成分，具有教強的合成膠原的能力，在一定條件下可以合成礦物鹽，為牙周膜韌帶的再附著創(chuàng)造條件，是正畸矯治力的直接效應(yīng)細(xì)胞，在牙周組織改建中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[7～9]。PDLC感受應(yīng)力刺激信號轉(zhuǎn)化為生物-化學(xué)信號，通過細(xì)胞骨架傳導(dǎo)至細(xì)胞的各個部位，并作為效應(yīng)性細(xì)胞產(chǎn)生一系列生物活化因子，如IP3、IGF-1、 BMP-2、 ALP等，使牙周膜膠原更新、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活化，其增殖活性和功能狀態(tài)也直接反映了牙周組織狀態(tài)[10～13]。胰島素樣生長因子是一類廣泛存在于機體多種組織中的蛋白多肽，在促進(jìn)機體的生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝、細(xì)胞分化、牙槽骨的再生修復(fù)以及正畸牙周組織改建過程中方面有著重要的生物學(xué)作用，本實驗通過轉(zhuǎn)染將外源性IGF-I基因?qū)塍w外培養(yǎng)的PDL細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞力學(xué)實驗，觀察IGF-I對PDLC的影響，進(jìn)而探討其對正畸牙周組織改建的作用機制。

細(xì)胞骨架(cytoskeleton，CSK)普遍存在于真核細(xì)胞胞漿和細(xì)胞核中，是由纖維狀結(jié)構(gòu)組成的蛋白質(zhì)網(wǎng)狀支架，為細(xì)胞形態(tài)的基礎(chǔ)。細(xì)胞骨架體系是一種動態(tài)結(jié)構(gòu)，當(dāng)外力超過細(xì)胞骨架抵抗變形能力時產(chǎn)生適應(yīng)性形變，為調(diào)節(jié)細(xì)胞-力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要環(huán)節(jié)[14,15]。α輔肌動蛋白(α-actin)為細(xì)胞骨架與細(xì)胞運動研究中的熱點蛋白，它是一種重要的肌動蛋白交聯(lián)蛋白，可通過與肌動蛋白結(jié)合來維持細(xì)胞的形態(tài)、賦予細(xì)胞強度和韌性；借助與鈣粘素、整合素等的協(xié)同作用，在調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀、穩(wěn)定細(xì)胞黏附和細(xì)胞運動中發(fā)揮重要作用[16,17]。研究應(yīng)力作用下α輔肌動蛋白表達(dá)水平的變化有利于進(jìn)一步了解應(yīng)力對細(xì)胞骨架變化的調(diào)節(jié)過程和機理。本實驗研究表明在周期性應(yīng)力作用下隨著加力時間增加α-肌動蛋白mRNA含量逐漸增高，加力3h、6h、12h和24h時α-actin mRNA的OD值與未加力時比較差異有顯著性，但加力24h與12h比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，也就是說加力12h是α-肌動蛋白對機械力刺激做出反應(yīng)最活躍的時點。結(jié)果提示機械力刺激可以引起牙周膜成纖維細(xì)胞的α-肌動蛋白含量的變化，進(jìn)而使細(xì)胞骨架形態(tài)發(fā)生改變以適應(yīng)細(xì)胞運動和形變。胰島素樣生長因子是一類多功能的細(xì)胞調(diào)控因子，在牙周組織中通過自分泌或旁分泌等形式刺激Ⅰ型膠原纖維的生成，增強牙周膜細(xì)胞ALP活性，促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的遷移、附著、增殖和分化，在牙周組織改建過程中發(fā)揮重要的作用[18～20]。本實驗成功的建立了轉(zhuǎn)染IGF-Ⅰ基因的牙周膜成纖維細(xì)胞，觀察在機械力加載的條件下其對α-肌動蛋白的影響，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)載IGF-I組的PDLCα-肌動蛋白mRNA含量變化趨勢與未轉(zhuǎn)染組相同，且相同加力時點其α-actin mRNA的OD值高于未轉(zhuǎn)染組，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本實驗證實機械力刺激會對細(xì)胞的形態(tài)和功能產(chǎn)生影響，牙周膜成纖維細(xì)胞對機械力刺激不僅是被動適應(yīng)，還有主動的力學(xué)反應(yīng)，IGF-I在PDLC對力信號刺激的主動反應(yīng)中主要是通過調(diào)節(jié)α-actin含量實現(xiàn)的。

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基金項目：①黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目，編號：12531706。

作者簡介:楊東紅(1982～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫(yī)師。 通訊作者:吳立鵬(1963～)男，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail: wlpkq@sina.com。

中圖分類號：R783.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1008-0104(2016)03-0010-03

(收稿日期：2016-01-26)

The effects of mechanical force loaded IGF-I transfected eriodontal ligament cells on α-actin

YANGDong-hong,FUShuang,FENGHui-shan,HOUYu-ze,ZHAOGang,YEZhi-hui,WULi-peng

(College of Stomatology of Jiamusi University, Jiamusi 154002,China)

Abstract:Objective: To investigate the effects of mechanical force loaded IGF-I transfected periodontal ligament cells on α-actin mRNA expression levels. Methods: Exogenous IGF-I was used to transfect human periodontal ligament. Four-point bending strain system acted on transfected groups and untransfected groups. α-actin mRNA was detected by RT-PCR at different time points. Results: Under mechanical stimulation, α-actin mRNA of cells in transfected groups and untransfected groups were rounded up significantly with loading time prolonged. Conclusion: IGF-I transfection had strong regulatory role to mechanical force loaded periodontal ligament cells on α-actin.

Key words：periodontal ligament cells；α-actin；transfection；IGF-I