韓奇鵬　羅　玲　揭紅東　王凱軍　張佩華*　周傳社　孔志偉　湯少勛

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,畜禽遺傳改良湖南省重點實驗室，長沙410128；2.中國科學(xué)院,亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所,亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測實驗站，長沙410125)

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瀏陽黑山羊瘤胃上皮細胞周期分布、增殖和凋亡特點

韓奇鵬1，2羅玲1揭紅東1王凱軍1張佩華1*周傳社2*孔志偉2湯少勛2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,畜禽遺傳改良湖南省重點實驗室，長沙410128；2.中國科學(xué)院,亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所,亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測實驗站，長沙410125)

摘要：本研究旨在建立瀏陽黑山羊瘤胃上皮細胞的體外培養(yǎng)模型，并對其周期分布、增殖和凋亡特點進行研究。試驗采集60日齡瀏陽黑山羊的瘤胃上皮組織，應(yīng)用0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化法對山羊瘤胃上皮組織進行消化，得到單個的山羊瘤胃上皮原代細胞進行體外培養(yǎng)。通過倒置顯微鏡對原代和傳代培養(yǎng)階段細胞形態(tài)進行觀察，采用細胞計數(shù)法檢測細胞的生長活性，應(yīng)用細胞免疫組化學(xué)方法對傳代細胞進行鑒定，并用流式細胞術(shù)檢測山羊瘤胃上皮傳代細胞周期分布情況和凋亡比率。結(jié)果顯示：1)經(jīng)0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化獲得的山羊瘤胃上皮原代細胞，培養(yǎng)1 d開始貼壁生長，2 d開始生長較快(對數(shù)期)，呈典型的“波峰”狀生長，3～4 d生長最為迅速，7 d生長速度平穩(wěn)(平臺期)。2)經(jīng)細胞免疫組化學(xué)方法的鑒定，細胞胞漿為黃褐色，即細胞角蛋白19呈陽性表達。3)膜聯(lián)蛋白-V/碘化丙啶聯(lián)合染色顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞凋亡比率顯著增加(P<0.01)。結(jié)果表明，通過0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA的消化方法成功得到了瀏陽黑山羊瘤胃上皮細胞，可為今后研究反芻動物瘤胃相關(guān)機制與功能提供模型。

關(guān)鍵詞：瀏陽黑山羊；瘤胃上皮細胞；周期分布；凋亡

瘤胃作為反芻動物重要的消化器官，了解瘤胃上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能，對維持消化系統(tǒng)穩(wěn)定和促進動物健康有著重要的實際意義。反芻動物瘤胃壁分為3層，由腔外向腔內(nèi)分別為豁漿膜層、豁膜肌層和膜層[1]。瘤胃壁中與其吸收代謝功能聯(lián)系最緊密的為瘤胃上皮。瘤胃上皮分為4個層，由漿膜層向黏膜層依次是角質(zhì)層、基底層、棘突層和顆粒層[2]。瘤胃上皮細胞分為基底層細胞、顆粒細胞、棘突層和顆粒層細胞，還有高度分化的角質(zhì)層細胞[3]。其中，去除角質(zhì)層細胞等雜細胞得到較多、較純及生命活性正常的處于中間層的棘突層和顆粒層細胞，是體外分離、培養(yǎng)瘤胃上皮細胞(ruminal epithelium cell，REC)的關(guān)鍵。Weekes[4]采用木瓜酶分裂乳頭組織，得到生長正常的離體上皮細胞。Gálfi等[5]為研究瘤胃上皮生酮，首次應(yīng)用胰蛋白酶連續(xù)消化法，先去除堅實的角質(zhì)層細胞，再連續(xù)消化，得到體外研究瘤胃營養(yǎng)代謝最佳的棘狀層和顆粒層細胞。之后他們又采用同樣的方法，成功地分離培養(yǎng)出了綿羊瘤胃上皮細胞，但是該法需約8 h從基底層和棘層中分離出細胞，限制了上皮細胞代謝研究中的應(yīng)用[6]。Klotz等[7]對消化緩沖液和胰蛋白酶濃度進行了優(yōu)化，獲得大量細胞形態(tài)正常的瘤胃上皮細胞。Stumpff等[8]在前人的基礎(chǔ)上改進了取材方法，設(shè)計制作了一種模具，使胰蛋白酶只作用于瘤胃乳頭，從而分離出較純凈的上皮細胞。范燕茹等[9]為建立馴鹿瘤胃上皮細胞的體外分離及培養(yǎng)方法，用0.25%胰蛋白酶(trypsin)+0.02%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)消化液37 ℃連續(xù)振蕩3～4 h消化上皮組織，得出傳1代的細胞活性正常的馴鹿原代離體瘤胃上皮細胞。

雖然國內(nèi)外對瘤胃上皮細胞已有研究，但只停留在獲取原代細胞到傳1代細胞，對其后續(xù)試驗研究少有報道。因此，本試驗以期建立一種有效、快速的獲得山羊瘤胃上皮細胞，且成功進行原代培養(yǎng)的模型，并對其周期分布情況和凋亡比率進行初步研究，為今后研究反芻動物瘤胃相關(guān)機制與功能提供技術(shù)支持和理論參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗動物為3只60日齡健康的瀏陽黑山羊，體重為(6.4±0.8) kg。頸靜脈放血致死，取出瘤胃組織，去掉內(nèi)容物后用生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，待用于樣品采集。

胎牛血清(FBS)、基本培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12，DMEM/F12)、0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA、青-鏈霉素均購自Gibico公司；兩性霉素B+慶大霉素(gentamicin/amphotericin solution)購自Thermo公司(R-015-10)；細胞計數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)購自日本同仁化學(xué)研究所；蘇木素和磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)(pH 7.2～7.6)均購自Wellbio公司；兩步法試劑盒和對二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒購自中山金橋公司；免疫組化細胞角蛋白19(cytokeratin-19，CK19)抗體購自Abcam公司；常規(guī)化學(xué)試劑購自上海國藥生物有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1山羊瘤胃上皮細胞的采集與原代培養(yǎng)

將瀏陽黑山羊稱重后，頸動脈放血至死，將腹部羊毛用解剖刀刮干凈后，新潔爾滅搽拭體表皮毛，置于試驗臺上，用棉花球沾醫(yī)用碘酒將腹部搽拭3遍，75%酒精1遍，切開腹部，取出瘤胃，用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水沖洗食糜顆粒后，置于無菌超凈臺中。采用鈍性剝離瘤胃上皮組織，用含2%青-鏈霉素、1%兩性霉素B和1%慶大霉素的洗滌液沖洗瘤胃上皮組織，并放入含2%青-鏈霉素、1%兩性霉素B和1%慶大霉素的DMEM/F12中帶回細胞培養(yǎng)室。用PBS清洗瘤胃上皮組織4～5次，剪去結(jié)締、脂肪及可見的導(dǎo)管組織。將瘤胃上皮組織塊盡量剪碎(約1 mm3，肉眼觀察呈糊狀)，再用PBS和DMEM/F12各洗滌1次。棄去上清液，往沉淀中加入3倍組織體積的0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液，37 ℃空氣浴振蕩消化10 min，消化完成后1 000 r/min條件下離心5 min，取上清液(盡量吹吸，促進單個細胞分離)，重復(fù)3～5次。再將收集的消化液加入適量DMEM/F12完全培養(yǎng)液(含5% FBS、10%青-鏈霉素、0.1 mg/mL慶大霉素、2.5 μg/mL兩性霉素B)重懸細胞，之后依次經(jīng)100 μm孔徑篩網(wǎng)過濾，收集濾液，1 000 r/min離心5 min，去上清，此時可看到細胞沉淀，如果含有黑色細胞層或角質(zhì)化細胞，則舍去(成年羊通常第1次與第2次消化得到的細胞舍去)。再往沉淀中加入PBS重懸細胞，繼續(xù)1 000 r/min條件下離心5 min，棄上清，加入適量DMEM/F12培養(yǎng)液垂懸細胞，細胞濃度調(diào)整為1×107個/mL，接種于事先準(zhǔn)備的培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)培養(yǎng)。培養(yǎng)30～60 min后，顯微鏡下觀察，吸出上清液，1 000 r/min條件下離心5 min，取沉淀，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2山羊瘤胃上皮細胞傳代培養(yǎng)

當(dāng)山羊瘤胃上皮原代細胞長滿培養(yǎng)皿的80%～90%時，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞1～2次后，加入1 mL的含0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA的消化液，放入含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中消化2～3 min。放在倒置顯微鏡下觀察細胞開始變亮、變圓時，迅速用含血清的培養(yǎng)基終止消化。將貼壁的細胞吹打為懸液，轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，在4 ℃離心機中1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入1 mL的培養(yǎng)基重懸細胞，以1∶2進行傳代。在含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后，轉(zhuǎn)移含細胞的培養(yǎng)基至培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)1次，此步為純化過程。

1.2.3山羊瘤胃上皮原代和傳代細胞形態(tài)學(xué)觀察

采用徠卡DMI3000B型倒置顯微鏡觀察山羊瘤胃上皮原代和傳代細胞形態(tài)及生長狀況。

1.2.4山羊瘤胃上皮傳代細胞免疫組化學(xué)鑒定

根據(jù)上皮細胞的標(biāo)志性中間絲蛋白為細胞角蛋白，對山羊瘤胃上皮傳代細胞角蛋白進行細胞免疫組化學(xué)的鑒定。

步驟：1)取對數(shù)生長的山羊瘤胃上皮傳代細胞用37 ℃的0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化液消化下來，當(dāng)培養(yǎng)在6孔板進行常規(guī)的蓋玻片爬片傳代培養(yǎng)山羊瘤胃上皮細胞，待生長到細胞培養(yǎng)瓶的80%～90%(3 d)。2)取出爬片，先加入PBS清洗數(shù)次后，再加入4%的多聚甲醛固定液固定30 min，室溫干燥5 min，用PBS沖洗3次，每次為3 min。3)每個孔滴加2滴或100 μL 3%濃度的H2O2，室溫下孵育10 min(此步是為了阻斷內(nèi)源性過氧化物物酶的干擾)。用PBS沖洗3次，每次為3 min。4)除去PBS，加封閉血清孵育20 min；每孔加入2滴或100 μL的CK19抗體，37 ℃孵育60 min；再用PBS沖洗3次，每次為3 min。放入濕盒中再放入4 ℃冰箱過夜，放入冰箱時要注意平穩(wěn)，以防止抗體從組織上滑落下來，次日放入37 ℃恒溫箱復(fù)溫45 min。5)PBS洗滌5次，每次5 min；每孔滴加50～100 μL抗兔/鼠免疫球蛋白G-辣根過氧化物酶(HRP)多聚體，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次為3 min。6)除去PBS，每孔加入300～400 μL新鮮配制的DAB染色液，顯微鏡下觀察1～5 min。7)蒸餾水沖洗10 min，蘇木精復(fù)染5～10 min，0.25%濃度的鹽酸酒精分化5～10 s，PBS藍化20 min，各級酒精(60%～100%)脫水，每級5 min，取出后置于二甲苯內(nèi)10 min，重復(fù)2次，中性樹膠封片、顯微鏡觀察。

1.2.5山羊瘤胃上皮傳代細胞生長活性檢測

步驟：1)取對數(shù)生長的山羊瘤胃上皮傳代細胞用37 ℃的0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化液消化下來，在96孔板中配制100 μL的細胞懸液(3×103個/孔)，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37 ℃，5% CO2)。2)對培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7、8、9 d的山羊瘤胃上皮傳代細胞進行檢測，并設(shè)置不含細胞的培養(yǎng)基為對照。3)向每孔加入10 μL CCK溶液[注意不要再孔中生成氣泡，它們會影響光密度(optical density，OD)值的讀數(shù)]。4)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。5)用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的OD(OD450 nm)。6)以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，OD450 nm為縱坐標(biāo)，繪制曲線圖。

1.2.6山羊瘤胃上皮傳代細胞周期分布情況

利用流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測原代不同培養(yǎng)天數(shù)山羊瘤胃上皮傳代細胞周期分布情況。

1)細胞培養(yǎng)：山羊瘤胃上皮傳代細胞培養(yǎng)于含5% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，收集培養(yǎng)了2、4、8 d的傳代細胞進行周期檢測，每組重復(fù)3次。

2)細胞收集：上述處理好的山羊瘤胃上皮細胞，用37 ℃的0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化液消化下來，PBS洗2～3次，制成單細胞懸液，并調(diào)整細胞數(shù)量至1×106個/mL。

3)細胞固定：加入1 mL預(yù)冷PBS重懸細胞，800 r/min×5 min，吸凈上清；加入400 μL PBS，輕輕重懸細胞，使細胞分離為單個，逐滴加入預(yù)冷的100%乙醇1.2 mL，使其終濃度為75%，4 ℃放置過夜固定。

4)細胞標(biāo)記：①取出固定的樣品，800 r/min，離心5 min，棄上清；②加入1 mL預(yù)冷的PBS重懸細胞，800 r/min，離心5 min，離心收集細胞；③重復(fù)1～2次，去除乙醇；④加入150 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)工作液，4 ℃避光染色30 min；⑤轉(zhuǎn)至流式檢測管，上機檢測，PI用488 nm氬離子激光器激發(fā)，由630 nm通濾光片接收，通過熒光脈沖前向角散射/熒光脈沖側(cè)向角散射(FSC/SSC)散點圖收集1×104個細胞，采用設(shè)門技術(shù)，排除黏連細胞和碎片，分析PI熒光直方圖上各細胞周期的百分率。

1.2.7山羊瘤胃上皮傳代細胞凋亡比率

山羊瘤胃上皮傳代細胞培養(yǎng)于含5% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，收集培養(yǎng)了2、4、8 d的傳代細胞進行凋亡檢測，每組重復(fù)3次。步驟：1)用不含EDTA的胰蛋白酶消化液消化，并收集山羊瘤胃上皮傳代細胞；2)用PBS洗滌細胞2次，每次2 000 r/min離心5 min，收集1×105～5×105個細胞；3)加入500 μL的結(jié)合緩沖液(binding buffer)懸浮細胞；4)加入5 μL膜聯(lián)蛋白V(annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)細胞凋亡檢測試劑盒中的試劑混勻后，加入5 μL PI，混勻；5)室溫、避光，反應(yīng)5～15 min；6)1 h內(nèi)，上流式細胞儀觀察檢測。

1.3數(shù)據(jù)分析

免疫組化學(xué)的采像用普通的電腦采像，圖像分析軟件為專業(yè)圖像分析軟件(Image-Pro-Plus，IPP)；細胞周期與凋亡應(yīng)用流式細胞儀(BD FACSCalibur)采集數(shù)據(jù)，并用專業(yè)軟件(Flowjo)進行圖像分析。試驗數(shù)據(jù)用SAS 9.2軟件統(tǒng)計分析，統(tǒng)計差異顯著性定義為P<0.01，P>0.01則無顯著差異。

2結(jié)果

2.1山羊瘤胃上皮原代和傳代細胞形態(tài)

山羊瘤胃上皮原代和傳代細胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA酶消化第4次離心后會看到大量的細胞白色沉淀，直到消化至第6次時細胞數(shù)量開始減少，且組織變得黏膩。收集后在顯微鏡下觀察，可見較多的細胞，且單個散在，大小均一，具有較好的折光度(圖1-A)。調(diào)整細胞密度進行培養(yǎng)，培養(yǎng)2 d后大部分貼壁，有未貼壁懸浮的細胞，細胞顏色發(fā)暗，并開始生長，呈島嶼狀分布，細胞折光度較好，形態(tài)較圓，體積較小(圖1-B)。4 d后開始迅速生長，細胞增殖明顯，顯現(xiàn)典型的鵝卵石狀，進入對數(shù)生長期(圖1-C)。經(jīng)過3～4次的傳代純化培養(yǎng)，得到較純的山羊瘤胃上皮細胞，呈現(xiàn)典型的鵝卵石狀(圖1-D)。

A.原代培養(yǎng)1 d的山羊瘤胃上皮細胞；B.原代培養(yǎng)2 d的山羊瘤胃上皮細胞；C.原代培養(yǎng)4 d培養(yǎng)的山羊瘤胃上皮細胞；D.純化傳代培養(yǎng)4 d的山羊瘤胃上皮細胞。

A. goat ruminal epithelial cells of primary culture of 1 d; B. goat ruminal epithelial cells of primary culture of 2 d; C. goat ruminal epithelial cells of primary culture of 4 d; D. goat ruminal epithelial cells of purified subculture of 4 d.

圖1山羊瘤胃上皮細胞形態(tài)

Fig.1Morphology of ruminal epithelium cells of goats (200×)

2.2山羊瘤胃上皮傳代細胞免疫組化學(xué)鑒定

經(jīng)細胞免疫組化學(xué)方法的鑒定，細胞胞漿為黃褐色，即細胞CK19呈陽性表達(圖2)，證明培養(yǎng)的細胞為山羊瘤胃上皮傳代細胞。

A與B為CK19陽性細胞漿表達；C與D為PBS陰性對照。A、B、C、D蘇木素細胞核染色。

A and B were CK19 positive expression in cell plasma; C and D were PBS negative control. A, B, C and D were haematoxylin nuclear staining.

圖2山羊瘤胃上皮傳代細胞免疫組化學(xué)鑒定

Fig.2Immunohistochemical identification of subcultured ruminal epithelium cells of goats (100×)

2.3山羊瘤胃上皮傳代細胞生長活性

不同培養(yǎng)時間山羊瘤胃上皮傳代細胞的生長活性測定結(jié)果如圖3所示。山羊瘤胃上皮傳代細胞的生長曲線呈典型“S”型。細胞增殖過程，1～2 d為潛伏期，細胞生長緩慢；3～7 d為對數(shù)生長期，生長較快；7～8 d為平臺期，細胞增殖相對平穩(wěn)；8 d后進入衰退期，細胞增殖活性開始降低。

圖3　山羊瘤胃上皮傳代細胞生長曲線Fig.3　The growth curve of subcultured ruminal epithelium cells of goats

2.4山羊瘤胃上皮傳代細胞周期分布情況

不同培養(yǎng)時間山羊瘤胃上皮傳代細胞周期分布情況如圖4所示。細胞周期一般分為G0/G1、S、G2/M期3部分，在G0/G1期前面都有個凋亡峰(也稱sub-G0期)，證明有細胞凋亡，且最前面沒有細胞碎片峰，證明分析時細胞窗口已經(jīng)設(shè)置好。此外，變異系數(shù)(CV)都小于10%，峰形越好，越尖銳，結(jié)果越可信。應(yīng)用SAS 9.2統(tǒng)計分析結(jié)果(表1)發(fā)現(xiàn)隨培養(yǎng)天數(shù)的增加，處于G0/G1期的細胞數(shù)量顯著減少(P<0.01)，而處于S期和G2/M期的細胞數(shù)量顯著增加(P<0.01)。

Channels(FL2-A-PI-Area)為PI紅色熒光通過PI通道(FL2)的熒光峰面積；Number為細胞數(shù)量。G1為DNA合成前期(第1紅色峰)；S為DNA合成期；G2為DNA合成后期(第2紅色峰)。每個時間點2個圖分別為2個重復(fù)的。

Channels(FL2-A-PI-Area) was fluorescence peak area of PI red fluorescence passed PI channel (FL2); Number was the number of cells. G1was early stage of DNA synthesis (the 1st red peak); S was DNA synthesis stage; G2was late stage of DNA synthesis (the 2nd red peak). Two figures at each time point were two replicates.

圖4山羊瘤胃上皮傳代細胞周期分布情況

Fig.4Distribution of cell cycle of subcultured ruminal epithelium cells of goats

2.5山羊瘤胃上皮傳代細胞凋亡比率

本試驗采用流式細胞術(shù)(膜聯(lián)蛋白V/PI雙染法)檢測不同培養(yǎng)時間山羊瘤胃上皮傳代細胞凋亡的結(jié)果，如圖5所示。通過BD FACSCalibur流式細胞儀采集數(shù)據(jù)，并用Cell Flowjo專用軟件分析，得出細胞凋亡的3個時期凋亡早期(LR)、凋亡中期(UR)、凋亡晚期/壞死(UL)細胞所占的百分比，通過公式“凋亡率(%)=LR+UR+UL”得出山羊瘤胃上皮傳代細胞凋亡比率。應(yīng)用SAS 9.2軟件進行統(tǒng)計分析(表2)發(fā)現(xiàn)，8 d凋亡比率顯著高于2、4 d(P<0.01)。這說明隨著細胞培養(yǎng)時間的延長，細胞凋亡比率增加，到8 d時增加的更為明顯。

表1　不同細胞培養(yǎng)時間山羊瘤胃上皮傳代細胞周期分布Table 1　Cell cycle distribution of subcultured ruminal epithelial cells of goats at different culture time

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母者差異顯著(P<0. 01)。下表同。

Values in the same row with different letter superscripts differed significantly (P<0. 01). The same as below.

PI：碘化丙啶；AV-FITC：膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素。RFI:相對熒光強度;CC:細胞數(shù)。LR：凋亡早期；UR：凋亡中期；UL：凋亡晚期/壞死；LL：正常細胞。

PI: propidium iodide; AV-FITC: annexin-fluorescein isothiocyanate. RFI: the relative fluorescence intensity; CC:cell count. LR: early apoptosis; UR: middle apoptosis; UL: late apoptosis/necrosis; LL: normal cells.

圖5　山羊瘤胃上皮傳代細胞凋亡比率Fig.5　Apoptosis ratio of subcultured ruminal epithelium cell of goats表2　不同細胞培養(yǎng)時間山羊瘤胃上皮傳代細胞凋亡比率Table 2　Apoptosis ratio of subcultured ruminal epithelium cells of goats at different culture time　%

3討論

3.1山羊瘤胃上皮細胞體外分離與培養(yǎng)

體外分離培養(yǎng)一般分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)2大類[10]，而原代培養(yǎng)方法通常分為時間段、產(chǎn)量高、形態(tài)分化良好、組織需要量大的酶消化法和易脫落、成功率低、培養(yǎng)時間長、需要組織量少的組織塊培養(yǎng)方法[11]。孫志洪等[12]針對建立山羊瘤胃上皮細胞(RNC)的原代培養(yǎng)方法進行研究，發(fā)現(xiàn)瀏陽黑山羊瘤胃上皮組織用2.50%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化后獲得的細胞分離效果及細胞增殖活性最為理想，可用于原代培養(yǎng)。于是本試驗應(yīng)用2.50% 胰蛋白酶+0.02% EDTA消化液10 min連續(xù)消化的方法，100 μm孔徑篩網(wǎng)過濾，得到較多、活力較強的單個細胞。此外，本試驗在瘤胃組織取樣中采用的組織洗滌液和原代細胞培養(yǎng)液中加入了2%青-鏈霉素、1%慶大霉素和兩性霉素B，瘤胃上皮細胞可傳代到4代以上，且細胞生長活性及形態(tài)正常。

由于原代細胞在培養(yǎng)過程中會參雜有生長速度比上皮細胞快的成纖維細胞[13]。根據(jù)成纖維細胞對胰蛋白酶+EDTA較敏感，較先脫落，且易貼壁等特點進行細胞純化[14]。細胞純化方法有很多種，常用的方法有相差消化法、相差貼壁法和刮除法等[15]，還有克隆環(huán)和96孔有限稀釋法等[16]。Inooka等[17]應(yīng)用相差消化法，以胰酶消化預(yù)處理，再用胰酶消化約2 h，使上皮細胞和成纖維細胞分離，并成功培養(yǎng)出瘤胃上皮細胞。而本試驗采用了相差貼壁的方法。具體操作是待原代細胞生長至鋪面培養(yǎng)皿底面積的80%～90%時，棄掉培養(yǎng)基，用含2%青-鏈霉素的PBS洗滌2～3次，再用0.25%胰蛋白酶-EDTA進行消化處理；消化處理后垂懸的細胞放入37 ℃含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)30 min，轉(zhuǎn)移含細胞的培養(yǎng)基到新的培養(yǎng)皿中，重復(fù)操作1次，經(jīng)過2～3代的純化后，可得到較純(80 %)的瘤胃上皮細胞。

3.2山羊瘤胃上皮傳代細胞凋亡比率與細胞周期分布情況

隨著細胞與分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展進步，對細胞凋亡的機理認識不斷成熟，相應(yīng)的檢測細胞凋亡技術(shù)隨之完善，主要包括流式細胞術(shù)DNA瓊脂糖凝膠電泳、電化學(xué)方法、蛋白質(zhì)印跡(Western blot)、原位末端缺Ⅱ標(biāo)記、RNA的逆轉(zhuǎn)錄和cDNA的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U增反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)等[18-20]。其中流式細胞術(shù)根據(jù)凋亡細胞從細胞核、細胞器到細胞膜均發(fā)生不同程度的細胞生物學(xué)和生物化學(xué)改變的特性，對凋亡細胞進行快速定量檢測。流式細胞術(shù)不但可以檢測處于細胞凋亡中、晚期的細胞，而且可以檢測出處于凋亡早期的細胞。

本試驗采用膜聯(lián)蛋白V和PI聯(lián)合染色法檢測不同培養(yǎng)天數(shù)山羊瘤胃上皮傳代細胞凋亡比率，發(fā)現(xiàn)凋亡比率隨時間的增加而增加，到8 d時增加的最多。引起細胞凋亡比率升高的原因可能與極性線粒體受損有關(guān)。譚秀文等[21]采用玫瑰紅123(rhodamine 123)熒光染色和PI聯(lián)合染色發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡比率與極性線粒體受損呈正相關(guān)。這是由于線粒體內(nèi)自由基的積累導(dǎo)致極性線粒體膨大，線粒體內(nèi)膜產(chǎn)生非特異性孔道，使一些啟動細胞凋亡的物質(zhì)流至胞質(zhì)進而誘導(dǎo)細胞凋亡[22]。此外，本試驗應(yīng)用流式細胞術(shù)對不同培養(yǎng)天數(shù)的山羊瘤胃上皮傳代細胞周期分布情況進行檢測。結(jié)果顯示，2、4、8 d內(nèi)增殖期(S、G2/M期)細胞數(shù)量明顯增多，而靜止期(G0/G1期)細胞數(shù)量明顯減少。這說明培養(yǎng)時間的延長對細胞由靜止期進入增殖期沒有產(chǎn)生嚴(yán)重的影響?？赡艿脑蚴请S著時間增加，DNA聚合酶、RNA聚合酶、基因調(diào)節(jié)蛋白或細胞自身遺傳物質(zhì)未發(fā)生損傷。但是，細胞凋亡卻隨著培養(yǎng)時間的延長，凋亡比率隨之增加，這與G0/G1期阻滯成負相關(guān)，所以，此問題有待進一步對凋亡機制進行試驗研究。

4結(jié)論

① 應(yīng)用0.25 %胰蛋白酶+0.02% EDTA連續(xù)消化及相差貼壁的方法得到較多、較純，且細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常和生命活性較強的山羊瘤胃上皮細胞。

② 應(yīng)用細胞免疫組化學(xué)方法對山羊瘤胃上皮傳代細胞進行鑒定，細胞胞漿為黃褐色，即細胞CK19呈陽性表達。

③ 采用細胞計數(shù)法檢測山羊瘤胃上皮傳代細胞的生長活性，其生長活性曲線呈典型“S”型。

④ 采用膜聯(lián)蛋白V和PI聯(lián)合染色法檢測原代細胞不同培養(yǎng)天數(shù)山羊瘤胃上皮傳代細胞凋亡比率，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞凋亡比率顯著增加，到8 d時增加的最多。

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(責(zé)任編輯王智航)

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.07.034

收稿日期：2016-01-25

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目(31372342)；國家科技支撐計劃課題(2012BAD14B17)；中國科學(xué)院科技服務(wù)網(wǎng)絡(luò)計劃(STS計劃)課題(KFJ-EW-STS-071)

作者簡介：韓奇鵬(1988—)，男，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士研究生，研究方向反芻動物營養(yǎng)。E-mail: 18711069677@163.com *通信作者：張佩華，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: peiqin41-@163.com；周傳社，研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail: zcs@isa.ac.cn

中圖分類號：S826

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-267X(2016)07-2269-09

*Corresponding authors: ZHANG Peihua, associate professor, E-mail: peiqin41-@163.com; ZHOU Chuanshe, professor, E-mail: zcs@isa.ac.cn

Characteristics of Ruminal Epithelium Cell Cycle Distribution,Proliferation and Apoptosis ofLiuyangBlack Goats

HAN Qipeng1,2LUO Ling1JIE Hongdong1WANG Kaijun1ZHANG Peihua1*ZHOU Chuanshe2*KONG Zhiwei2TANG Shaohui2

(1. Hunan Provincial Key Laboratory for Genetic Improvement of Domestic Animal, College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Key Laboratory for Agro-Ecological Processes in Subtropical Region, Hunan Research Center of Livestock &Poultry Sciences, South-Central Experimental Station of Animal Nutrition and Feed Science of Ministry of Agriculture, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China)

Abstract:The present study was carried out to establish an in vitro culture model of rumen epithelial cells of Liuyang black goats and investigated cell cycle distribution, proliferation and apoptosis. Ruminal epithelium tissue of 60-day-old Liuyang black goats was collected, and digested with 0.25% trypsin and 0.02% ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) to obtain individual primary cultured ruminal epithelium cells for in vitro culture. The morphous of ruminal epithelial cells in primary culture and subculture was observed under inverted microscope, the growth activity curve of cells was tested by cell number count assay, the identification of subcultured ruminal epithelium cells was carried out using the method of immunohistochemistry, and the subcultured ruminal epithelium cells cycle distribution and apoptosis ratio were determined through flow cytometry method. The results showed as follows: 1) the primary cultured ruminal epithelium cells of goats were obtained by digestion of 0.25% trypsin and 0.02% EDTA, began adherent growth after cultured for 1 d, an exponential growth started and resembled a “hill” in appearance since 2 d, the cell growth rate reached the highest at 3 to 4 d, and got stable at 7 d. 2) Identified by immunohistochemistry method, the cytoplasm was brown, which meant that cytokeratin 19 (CK19) was positive expressed. 3) The combination staining of Annexin V and propidium iodide showed that the apoptosis ratio of cells significantly increased with the prolongation of culture time (P<0.01). In conclusion, the ruminal epithelium cells of Liuyang black goats are obtained successfully by the method of 0.25% trypsin+0.02% EDTA digestion, which provided cell model for further study on mechanism and the function of ruminant rumen.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(7)：2269-2277]

Key words:Liuyang black goat; ruminal epithelium cell; cycle distribution; apoptosis