丁協(xié)剛，李世文，鄭新民，胡萬里，羅　儀，王行環(huán)

(武漢大學中南醫(yī)院泌尿外科, 湖北 武漢　430071)

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·基礎研究·

富血小板血漿對大鼠海綿體神經(jīng)損傷的修復效應

丁協(xié)剛，李世文，鄭新民，胡萬里，羅儀，王行環(huán)

(武漢大學中南醫(yī)院泌尿外科, 湖北 武漢430071)

摘要：目的探討富血小板血漿對大鼠海綿體神經(jīng)損傷的修復效應。方法24只SD雄性大鼠隨機分成假手術(shù)組、雙側(cè)海綿體神經(jīng)鉗夾損傷組及損傷后富血小板血漿治療組,術(shù)后3個月通過電刺激觀察海綿體內(nèi)壓的變化來反映其勃起功能,隨后取海綿體神經(jīng)干進行甲苯胺藍染色觀察有髓鞘軸突的數(shù)目變化及陰莖組織行煙酰胺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)染色檢測一氧化氮合酶(NOS)陽性神經(jīng)纖維數(shù)目來反映神經(jīng)再生情況。結(jié)果術(shù)后3個月,損傷組最大海綿體內(nèi)壓為(32.7±12.2)cmH2O,明顯低于假手術(shù)組(108.9±12.8)cmH2O(P<0.01);而富血小板血漿治療組為(83.1±12.9)cmH2O,明顯高于損傷組(P<0.01)。甲苯胺藍染色損傷組的有髓鞘軸突個數(shù)為(60.3±14.5)個，明顯低于假手術(shù)組(180.9±20.7)個，(P<0.01)，而富血小板血漿治療組為(114.9±23.9)個，明顯高于損傷組(P<0.01)。陰莖背神經(jīng)NOS陽性神經(jīng)纖維數(shù)目，治療組為(151.8±20.3)個與假手術(shù)組(285.6±57.3)個和損傷組(77.5±16.6)個相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結(jié)論局部應用富血小板血漿能明顯促進受損海綿體神經(jīng)的神經(jīng)修復和勃起功能的恢復。

關鍵詞:富血小板血漿；海綿體神經(jīng)； 勃起功能障礙

富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)是通過離心全血而得到的血小板濃縮物。基于血小板激活時可釋放多種生長因子這一特性，國內(nèi)外大量的文獻報道PRP在細胞水平和實驗動物和臨床應用方面對骨組織修復有促進作用[1～3]。但關于其對外周神經(jīng)的修復作用，報道相對較少[4～6]，我們就其對陰莖海綿體神經(jīng)(cavernous nerve,CN)損傷的修復效應進行了探討，現(xiàn)報告如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物和試劑SD雄性大鼠30只(購于武漢大學醫(yī)學院實驗動物中心)，3月齡，體重250～300 g，經(jīng)性交配實驗證實均有正常性功能。手術(shù)顯微鏡(SXP-1B型，上海醫(yī)用儀器廠)。生理記錄儀(BL420-E，成都泰盟)。凝血酶(1 000 U/mL，Sigma公司)。硝基四氮唑藍(NBT,Sigma 公司),β-NADPH(Sigma,type Ⅰ)。

1.2方法

1.2.1動物分組選取24只大鼠隨機分成3組，即假手術(shù)組、海綿體神經(jīng)損傷組、損傷后局部應用PRP組，每組8只。

1.2.2PRP的準備6只SD成年雄性大鼠，體重250～300 g，2%戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔麻醉后在無菌條件下經(jīng)心臟采血后注入抗凝的試管，立即行兩次離心得到PRP，22 ℃保存。術(shù)中局部應用前每200 μLPRP加入20 μL的CaCl2(100 mg/mL)和凝血酶(1 000 U/mL)的混合物，使其激活成凝膠狀，即可局部應用。

1.2.3手術(shù)方法20 g/L戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔麻醉后，取下腹正中切口，延長至陰莖根部，在手術(shù)顯微鏡下于兩側(cè)前列腺背外側(cè)找到盆神經(jīng)節(jié)及海綿體神經(jīng)(cavernous nerve,CN)，假手術(shù)組僅游離海綿體神經(jīng)而避免損傷；損傷組參照HEISH[7]的方法用顯微血管夾嵌夾海綿體神經(jīng)2 min，制作擠壓損傷模型；PRP應用組在造成損傷后立即在損傷的局部應用術(shù)中激活的PRP每側(cè)200 μL。

1.2.4陰莖海綿體內(nèi)壓測定術(shù)后3個月，各組大鼠再次20 g/L戊巴比妥(40 mg/kg)經(jīng)腹注射麻醉，找到CN，用連接有電刺激儀的雙極電極勾住CN；然后在下腹正中線與陰莖體背側(cè)交點始至龜頭下水平旁開中線約1 cm處作一約1.5 cm的斜形切口，分離陰莖體后用無損傷的血管夾鉗夾陰莖體，鈍性分離陰莖根部，從陰莖腳處切斷坐骨海綿體肌，暴露陰莖海綿體白膜，在陰莖腳處插入1只23號蝶型針頭，通過PE-50硅膠管與生理記錄儀的壓力傳感器相連。插入前針頭及導管內(nèi)吸入無菌的肝素溶液(250 U/mL)，防止血液凝固堵塞針頭和導管。刺激參數(shù)設置為1.5 mA、20 Hz、0.2 ms脈沖的電流持續(xù)刺激CN 50 s，記錄陰莖海綿體內(nèi)壓(intracavernous pressure, ICP)的變化。

1.2.5海綿體神經(jīng)的甲苯胺藍染色壓力測定完成后，立即取嵌夾處以遠3 mm的CN干置于20 g/L的戊二醛中前固定，20 g/L的餓酸后固定，逐級乙醇脫水, Epon 定向包埋, 中點半薄橫切片1 μm厚，經(jīng)1% 甲苯胺藍染色在Olympus-DP12顯微鏡下通過油鏡(×1 000)觀察整個橫切面有髓鞘軸突的個數(shù)。

1.2.6大鼠陰莖組織煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)染色CN取出后，立即取陰莖中段組織，置于新鮮配置的冷固定液中，4 h后將組織移入新鮮配置含30%蔗糖的冷PBS溶液中浸至沉底，OCT包埋。行冰凍切片厚8 μm，反應前空氣中干燥5 min；后移入孵育液[0. 1 mol/ L PBS(pH 8. 0)中含0. 2 %Triton-x 100,0. 8 g/ L 硝基四氮唑藍,1 g/ Lβ-NADPH中,37 ℃溫箱中孵育3～4 h，用0. 01 mol/ L PBS(pH7.4) 終止反應并漂洗數(shù)次,后予梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。Olympus BH2 顯微鏡放大400倍下觀察雙側(cè)陰莖背神經(jīng)中NADPH陽性染色神經(jīng)纖維的數(shù)目。

2結(jié)果

2.1陰莖海綿體內(nèi)壓測定結(jié)果損傷組最大海綿體內(nèi)壓為(32.73±12.21)cmH2O,明顯低于假手術(shù)組(108.87±12.84)cmH2O(P<0.01);而富血小板血漿治療組為(83.11±12.89)cmH2O,明顯高于損傷組(P<0.01)。

2.2甲苯胺藍染色結(jié)果損傷組(圖1A)的有髓鞘軸突為(60.3±14.5)個，明顯低于假手術(shù)組(圖1B) (180.9±20.7)個，(P<0.01)，且明顯發(fā)生軸突萎縮變小、間質(zhì)增生的變化；而富血小板血漿治療組(圖1C)有髓鞘軸突為(114.9±23.9)個，明顯高于損傷組(P<0.01)，但仍低于假手術(shù)組(P<0.01)，組織形態(tài)上明顯部分恢復。

圖1各組海綿體神經(jīng)干甲苯胺藍染色(×1 000)

A：損傷組；B：假手術(shù)組；C：富血小板血漿治療組

2.3陰莖組織NADPH染色結(jié)果光鏡下CN損傷組陰莖背神經(jīng)中NOS陽性神經(jīng)纖維明顯變少(圖2A);假手術(shù)組大鼠陰莖背神經(jīng)中有大量一氧化氮合酶陽性神經(jīng)纖維(圖2B)；富血小板血漿治療組NOS陽性神經(jīng)纖維明顯多于損傷組(圖2C)。損傷組、假手術(shù)組、富血小板血漿治療組陽性纖維計數(shù)分別為77.5±16.6、285.6±57.3、151.8±20.3。富血小板血漿治療組與損傷組和假手術(shù)組相比，均有顯著性差異(P<0.05)。

圖2各組陰莖組織NADPH染色結(jié)果(×400)

A：損傷組；B：假手術(shù)組；C：富血小板血漿治療組。

3討論

在前列腺癌根治術(shù)或盆腔其他手術(shù)的操作過程中，常因不慎導致CN的各種損傷：如切斷、撕裂、牽拉等[8]，所以術(shù)后勃起功能的恢復很大程度上依賴于殘存神經(jīng)的再生修復狀況。

神經(jīng)損傷后的自身修復是一個復雜的過程，大量的實驗證實外周神經(jīng)的生長需要各種因子。JUNG[9]等發(fā)現(xiàn)單側(cè)CN損傷的大鼠6個月后隨著陰莖含一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)神經(jīng)纖維的增多和勃起功能的改善，陰莖內(nèi)多種促神經(jīng)生長因子只有胰島素樣生長因子-Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)、轉(zhuǎn)化生長因子-β2(transforming growth factor-β2,TGF-β2)的表達顯著增加，提示IGF-Ⅰ 、TGF-β2在CN的再生中起重要作用。HEISH等[7]發(fā)現(xiàn)經(jīng)陰莖海綿體注射腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)有助于損傷的CN的恢復。后續(xù)有BELLA等[10]報導在CN損傷局部使用一種膠質(zhì)細胞系的神經(jīng)營養(yǎng)因子Neurturin可促進其功能的恢復。HANNAN等[11]通過離體組織培養(yǎng)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)BDNF、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)、膠質(zhì)細胞起源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)對CN再生起重要作用。因此有理由相信，神經(jīng)的修復是一個多因子參與的過程，而且這些因子不僅單獨起作用，另可有協(xié)同作用。

PRP是通過離心全血而得到的血小板濃縮物。血小板激活時，可釋放多種生長因子，如血小板源性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、轉(zhuǎn)化生長因子-β2、胰島素樣生長因子、表皮生長因子和血管內(nèi)皮生長因子等[12]。這些生長因子在PRP中的濃度很高，約為體內(nèi)正常濃度的3～17倍，它們對細胞的增殖、基質(zhì)合成及血管再生起著重要作用。結(jié)合PRP這一特性及CN損傷修復過程需要多因子的參與，因此我們有理由相信，PRP對CN損傷的修復有促進作用。

在本實驗中，我們通過嵌夾CN制作神經(jīng)性ED，并在損傷的局部應用激活的PRP；術(shù)后3個月，通過測定最大海綿體內(nèi)壓的變化，反映其勃起功能的恢復情況；甲苯胺藍染色來直接觀察起受損CN干組織結(jié)構(gòu)的修復狀態(tài)；另一方面通過陰莖背神經(jīng)NADPH染色來反映遠端神經(jīng)再生的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，損傷組ICP的變化明顯降低，且CN干橫切面有髓鞘軸突和陰莖背神經(jīng)中NOS陽性神經(jīng)纖維出現(xiàn)明顯萎縮和減少；應用PRP組，雖與假手術(shù)相比恢復情況還有一段距離，但與損傷組相比ICP的變化和CN干有髓鞘軸軸突的個數(shù)和陰莖背神經(jīng)中NOS陽性神經(jīng)纖維數(shù)目均得到了明顯恢復，兩者差異有統(tǒng)計學意義。由此可見，PRP對CN損傷的修復有明顯促進作用。這與我們實驗前的推斷是相吻合的。一方面，在損傷的局部應用激活的成凝膠狀的PRP可以覆蓋傷口，另一方面在局部能夠釋放各種神經(jīng)營養(yǎng)和生長因子，它們可以單獨或協(xié)同對殘存的神經(jīng)元進行營養(yǎng)和支持作用，促進軸突的再生，實現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的恢復。

綜上所述，富血小板血漿(PRP)能明顯促進受損海綿體神經(jīng)(CN)的神經(jīng)再生和其勃起功能的恢復。但PRP與其他單一因子對CN的修復效應的差別有待在后續(xù)研究中進一步論證。

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(編輯王瑋)

收稿日期：2015-05-14修回日期：2015-07-02

通訊作者:李世文，教授，主任醫(yī)師，博士生導師.E-mail:drlishiwen@sina.com

作者簡介:丁協(xié)剛(1980-)，男(漢族)，博士，主治醫(yī)師，主要從事泌尿外科及男科的基礎與臨床研究. E-mail:dxg1014@aliyun.com

中圖分類號:R698

文獻標志碼:A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.01.016

The therapeutic effect of platelet rich plasma in a rat model of cavernous nerve injury

DING Xie-gang, LI Shi-wen, ZHENG Xin-min, HU Wan-li, LUO Yi, WANG Xing-huan

(Department of Urology,Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effect of platelet rich plasma (PRP) on the recovery in a rat model of cavernous nerve injury. MethodsA total of 24 Sprague-Dawley male adult rats were equally randomized into 3 groups, receiving sham operation, bilateral cavernous nerve crushing with no further intervention, and bilateral cavernous nerve crushing with an immediate application of PRP to the site of cavernous nerve crush injury, respectively. Erectile function was assessed by cavernosal nerve electrostimulation after 3 months and nerve regeneration was assessed by toluidine blue staining of CN and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH)-diaphorase staining of penile tissue. ResultsThe mean maximal intracavernous pressure (ICP) in the PRP treated group (83.1±12.9)cmH2O was significantly higher than in injured control group (32.7±12.2, P<0.01), but lower than in sham group (108.9±12.8, P<0.01). The PRP treated group had more myelinated axons of CNs (114.9±23.9) than the injured control group (60.3±14.5, P<0.01), but fewer than the sham group (180.9±20.7, P<0.01). Furthermore, the PRP treated group had more NOS diaphorase positive nerve (151.8±20.3) than the injured control group (77.5±16.6, P<0.05), but fewer than the sham group (285.6±57.3, P<0.05). Conclusion The application of PRP to the site of CN-crush injury facilitates nerve regeneration and recovery of erectile function.

KEY WORDS:platelet rich plasma; cavernous nerve; erectile dysfunction