韓長(zhǎng)志　任文來(lái)

（1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650224；2.廊坊市文安縣農(nóng)業(yè)局，河北廊坊065800）

禾谷炭疽菌GPCR蛋白生物信息學(xué)分析

韓長(zhǎng)志1任文來(lái)2

（1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650224；2.廊坊市文安縣農(nóng)業(yè)局，河北廊坊065800）

基于釀酒酵母中已經(jīng)報(bào)道的3個(gè)典型GPCR序列，利用B1astP以及關(guān)鍵詞對(duì)炭疽菌蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)、搜索，通過(guò)SMART保守結(jié)構(gòu)域及遺傳關(guān)系分析。結(jié)果表明：發(fā)現(xiàn)該菌存在4個(gè)典型的GPCR；4個(gè)GPCR在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)上均含有典型的7跨膜結(jié)構(gòu)域以及較高比例的α螺旋結(jié)構(gòu)，均不含有明顯的信號(hào)肽序列；在定位方面，4個(gè)GPCR均定位在質(zhì)膜上；該菌中的GPCR 與C.higginsianum、C.fioriniae等炭疽菌屬中的病菌具有較高的同源序列以及較近的親緣關(guān)系。

禾谷炭疽菌；G蛋白偶聯(lián)受體；信號(hào)肽；二級(jí)結(jié)構(gòu)；生物信息學(xué)

禾谷炭疽菌 （Colletotrichum graminicola）侵染小麥（Triticum aestivum）、高粱 （Sorghum bicolor）等禾本科作物引起炭疽病，自20世紀(jì)70年代以來(lái)，由該菌引起的玉米（Zea mays）炭疽病在美國(guó)、印度等國(guó)就非常普遍，給各國(guó)農(nóng)業(yè)造成巨大損失［1-7］。隨著該菌全基因組序列的釋放［8］，目前，關(guān)于該菌 MAPK途徑蛋白預(yù)測(cè)［9］、分泌蛋白預(yù)測(cè)［10］以及14-3-3蛋白［11］和RGS［12］生物信息學(xué)分析等已見(jiàn)報(bào)道，而關(guān)于G蛋白信號(hào)通路效應(yīng)酶的報(bào)道尚不多見(jiàn)。G蛋白 （鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白，Guanine nuc1eotide binding Protein）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在植物與病原菌互作過(guò)程中，發(fā)揮著諸多重要的作用，該系統(tǒng)中用于感知碳源、信息素等外來(lái)信號(hào)途徑中的G蛋白偶聯(lián)受體（G Protein-couP1ed receP-tor，GPCR），則是接收外源信號(hào)、傳遞信號(hào)重要的表面受體［13］。前人利用TMHMM version 2.0、TMHMM version 1.0、HMMTOP以及DAS等15種常用的跨膜預(yù)測(cè)軟件對(duì)883個(gè)已經(jīng)在SWISS-PROT收錄的GPCR進(jìn)行分析，明確基于HMM算法的TMHMM和HMMTOP具有非常好的評(píng)價(jià)準(zhǔn)確性，而其他程序所預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率均較低［14］。在模式真菌粗糙脈孢霉 （Neurospora crassa）中已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 10個(gè)GPCR，可以分為5類(lèi)［15］。目前，有關(guān)擔(dān)子菌［16］、結(jié)合菌［16］、半知菌［17］中的GPCR亦有報(bào)道。

本研究利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）S288c中已經(jīng)報(bào)道的 3個(gè)典型 GPCR氨基酸序列［18］，通過(guò)在炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行B1astP比對(duì)分析、關(guān)鍵詞搜索，獲得與釀酒酵母GPCR同源的C.graminicola序列，選擇TMHMM和HMMTOP對(duì)GPCR進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并通過(guò)疏水性分析、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)以及信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位等生物信息學(xué)分析，以期明確該菌中所存在的GPCR數(shù)量、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征及定位情況，同時(shí)，基于上述獲得的GPCR氨基酸序列，在美國(guó)國(guó)家生物信息中心（NCBI）在線(xiàn)進(jìn)行同源序列搜索，通過(guò)遺傳關(guān)系分析，以期為進(jìn)一步開(kāi)展同屬于炭疽菌屬但其基因組序列尚未公布的其他炭疽菌的研究提供參考。

1　數(shù)據(jù)來(lái)源與方法

1.1數(shù)據(jù)來(lái)源

利用關(guān)鍵詞 “G-Protein couP1ed recePtor”及“GPCR”等對(duì)炭疽菌屬蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行在線(xiàn)搜索，同時(shí)，以S.cerevisiae S288c中3個(gè)GPCR（GCR1、STE2、STE3）蛋白序列為基礎(chǔ)，進(jìn)行B1astP比對(duì)分析。

1.2研究方法

1.2.1保守結(jié)構(gòu)域及跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用SMART網(wǎng)站［19］在線(xiàn)分析GPCR所具有的保守結(jié)構(gòu)域特征。利用TMHMM Server v.2.0［20］和HMMTOP version 2.0［21］等跨膜程序在線(xiàn)對(duì)GPCR的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.2蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及疏水性預(yù)測(cè)

利用Protsca1e程序［22］對(duì)GPCR進(jìn)行理化性質(zhì)及疏水性測(cè)定，疏水性測(cè)定Window參數(shù)選擇19。

1.2.3蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)肽及信號(hào)肽預(yù)測(cè)

對(duì)GPCR轉(zhuǎn)運(yùn)肽的預(yù)測(cè)利用TargetP 1.1 Server在線(xiàn)分析實(shí)現(xiàn)［23］，信號(hào)肽的預(yù)測(cè)則是利用Signa1P 4.1 Server［20］在線(xiàn)分析實(shí)現(xiàn)。

1.2.4蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用PHD［24］在線(xiàn)分析實(shí)現(xiàn)。

1.2.5亞細(xì)胞定位分析

對(duì)GPCR進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，利用ProtComP v9.0實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的定位情況。

1.2.6系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用C1usta1X［25］進(jìn)行多重比對(duì)分析，隨后利用MEGA 5.2.2軟件［26］構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1禾谷炭疽菌GPCR跨膜結(jié)構(gòu)域分析

通過(guò)同源比對(duì)搜索，發(fā)現(xiàn)與S.cerevisiae S288c 中STE3、GPR1同源的C.graminicola GPCR蛋白ID分別為GLRG_03765.1、GLRG_07152.1，并未發(fā)現(xiàn)與STE2同源的C.graminicola GPCR蛋白；另外，通過(guò)關(guān)鍵詞搜索，共獲得C.graminicola中2 個(gè)GPCR，其ID分別為GLRG_01258.1、GLRG_ 09043.1（表1）。根據(jù)序列彼此之間的同源結(jié)果，將上述所獲得的的GPCR蛋白分別命名為CgGPR1、CgGPR2、CgSTE3、CgGPR4。

表1　禾谷炭疽菌GPCR基本情況及獲取方法Tab1e 1　The information and access methods of four tyPica1 GPCRs in C.graminicola

基于SMART保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)上述4個(gè)GPCR均具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖1）。鑒于SMART程序?qū)τ诳缒そY(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)是基于TMHMM預(yù)測(cè)程序［19］，因此，為了更好地明確上述GPCR跨膜結(jié)構(gòu)域，本研究利用HMMTOP進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)上述2種預(yù)測(cè)方法均明確上述4個(gè)GPCR具有典型的7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，而對(duì)于具體的跨膜起始位置、終止位置預(yù)測(cè)并不相同（表2）。

圖1　禾谷炭疽菌GPCR的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.1　The conserved domain ana1ysis of GPCR in C.graminicola

表2　基于HMMTOP和TMHMM預(yù)測(cè)方法的禾谷炭疽菌GPCR跨膜情況Tab1e 2　The transmembrane of GPCR in C.graminicola based on the Prediction methods inc1uding HMMTOP and TMHMM

2.2GPCR蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及疏水性預(yù)測(cè)

C.graminicola中所含GPCR彼此之間不僅在酸性氨基酸、堿性氨基酸以及非極性R基氨基酸、不帶電荷的極性R基氨基酸方面組成及所占比例方面均存在不同，也在相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)、正電荷氨基酸殘基數(shù)以及不穩(wěn)定性系數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)、總平均親水性等方面均存在著一定差異（表3、表4）。

表3　禾谷炭疽菌GPCR氨基酸組成情況Tab1e 3　The amino acid comPosition situation of GPCRs in C.graminicola

表4　禾谷炭疽菌GPCR蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)Tab1e 4　The basic Physicochemica1 ProPerties of GPCRs in C.graminicola

同時(shí)，除CgGPR4不穩(wěn)定性系數(shù)小于40外，其他均大于40，屬于不穩(wěn)定蛋白；CgGPR1、CgGPR4總平均親水性（GRAVY）小于0，為親水性蛋白，而CgGPR2、CgSTE3為疏水性蛋白（表4）。

C.graminicola中4個(gè)GPCR在親（疏）水性最強(qiáng)氨基酸殘基及位置方面也存在著較大的差異（圖2、表5）。

2.3轉(zhuǎn)運(yùn)肽及信號(hào)肽特征

通過(guò)分析，C.graminicola中除CgSTE3定位于分泌途徑上外，其他GPCR均未得到有效的定位情況，且上述轉(zhuǎn)運(yùn)肽預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性均較低 （表6）。經(jīng)過(guò)Singna1P 3.0分析，無(wú)論是經(jīng)NN計(jì)算還是經(jīng)HMM分析，4個(gè)GPCR均未發(fā)現(xiàn)有明顯的信號(hào)肽序列。

圖2　禾谷炭疽菌GPCR疏水性分析

表5　禾谷炭疽菌GPCR疏水性及親水性氨基酸殘基位置情況Tab1e 5　The hydroPhobic and hydroPhi1ic amino acid residue Position situation of GPCRs in C.graminicola

表6　禾谷炭疽菌GPCR含有潛在轉(zhuǎn)運(yùn)肽預(yù)測(cè)Tab1e 6　The Possibi1ities of transit PePtide of GPCRs in C.graminicola

2.4二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

4個(gè)GPCR均含有較高比例的α螺旋，除Cg-GPR1具有一定比例的跨膜螺旋（TM he1ix）外，其他GPCR均不含有該結(jié)構(gòu) （圖3），推測(cè)該跨膜螺旋結(jié)構(gòu)可能作為新型GPCR的一種特征而發(fā)揮作用，其作用有待于生物學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步研究明確。

2.5亞細(xì)胞定位分析

4個(gè)GPCR亞細(xì)胞定位情況均為質(zhì)膜 （表7），該結(jié)果與通過(guò)SMART分析以及跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果一致，同時(shí)，也符合GPCR所具有的功能特征。

圖3　禾谷炭疽菌GPCR的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.3　The secondary structure character of GPCRs in C.graminicola

2.6遺傳關(guān)系

通過(guò)對(duì)C.graminicola中的4個(gè)GPCR序列及其同源序列進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果顯示，分別以Cg-GPR1、CgGPR2、CgSTE3以及CgGPR4為核心，分為明顯的4大類(lèi)，就上述GPCR親緣關(guān)系而言，CgGPR1、CgGPR2和CgGPR4彼此之間親緣關(guān)系較近，其中，CgGPR2和CgGPR4彼此之間的親緣關(guān)系更近。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)該菌中的GPCR與希金斯炭疽菌C.higginsianum、尖孢炭疽菌C.fioriniae等病菌具有較高的同源序列以及較近的親緣關(guān)系（圖4）。

表7　禾谷炭疽菌GPCR亞細(xì)胞定位情況Tab1e 7　The subce11u1ar 1oca1ization of GPCRs in C.graminicola

圖4　禾谷炭疽菌GPCR與其同源GPCR之間的遺傳關(guān)系分析Fig.4　The genetic re1ationshiPs of GPCRs in C.graminicola comPared with its homo1ogous sequences from other sPecies

3　結(jié)論與討論

本研究明確C.graminicola中存在4個(gè)GPCR，并利用SMART、Signa1P、PHD、Protsca1e、TargetP等生物信息學(xué)分析網(wǎng)站，明確其保守結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、理化性質(zhì)、疏水性、亞細(xì)胞定位等情況；此外，通過(guò)遺傳關(guān)系分析，明確上述GPCR及其同源序列之間存在較近的親緣關(guān)系。

典型的GPCR在二級(jí)結(jié)構(gòu)上具有7跨膜結(jié)構(gòu)域，該特征作為GPCR的重要特征，受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注［27］。通過(guò)對(duì)S.cerevisiae S288c中GPR1、STE2、STE3保守結(jié)構(gòu)域分析，明確GPR1僅具有6次跨膜結(jié)構(gòu)域，其他STE2、STE3均具有典型的7次跨膜結(jié)構(gòu)域，而本研究中所獲得的4個(gè)GPCR均具有典型的7次跨膜結(jié)構(gòu)域，因此，7跨膜結(jié)構(gòu)域是否為GPCR所具有的唯一典型特征有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，由于絲狀真菌與釀酒酵母之間的G蛋白亞基、GPCR存在一定的差異［13］，本研究結(jié)果能否完全反映出禾谷炭疽菌中存在的GPCR還存在一定的異議，盡管如此，該研究對(duì)于開(kāi)展炭疽菌屬真菌GPCR的功能研究仍然具有一定的參考。

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（責(zé)任編輯張坤）

Bioinformatics Ana1ysis on G Protein-couP1ed RecePtors in Colletotrichum graminicola

Han Changzhi1，Ren Wen1ai2

（1.The Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Contro1 of Yunnan Province，Co11ege of Forestry，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，China；2.Agricu1ture Bureau of Wen′an County，Langfang Hebei 065800，China）

Based on three tyPica1 GPCR sequences have been rePorted in Saccharomyces cerevisiae，to comPare and search the Protein databases of Colletotrichum sPP.with the B1astP as we11 as the use of keywords，and four tyPica1 GPCRs are identified by conserved domain ana1ysis in the SMART on1ine.Meanwhi1e，there is seven trans-membrane domain and high ProPortion of he1ica1 structure in every GPCR Protein in the secondary Protein structure，which Positioned in the P1asma membrane and not contains significant signa1 PePtide sequence.In addition，both C.higginsianum and C.fioriniae have a high sequence homo1ogy and c1ose genetic re1ationshiP with C.graminicola.

Colletotrichum graminicola，GPCR，signa1 PePtide，secondary structure，Colletotrichum sPP.

S763.1；S435.1

A

2095-1914（2016）04-0082-06

10.11929/j.issn.2095-1914.2016.04.014

2015-09-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31560211）資助；云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目 （ZK150004）資助；云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目（2014Y330）資助；云南省優(yōu)勢(shì)特色重點(diǎn)學(xué)科生物學(xué)一級(jí)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目 （50097505）資助；云南省高校林下生物資源保護(hù)及利用科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（2014015）資助。
第1作者：韓長(zhǎng)志（1981—），男，博士生，講師。研究方向：經(jīng)濟(jì)林木病害生物防治與真菌分子生物學(xué)。Emai1：hanchangzhi2010@163.com。

任文來(lái)（1979—），男，本科。研究方向：農(nóng)作物病蟲(chóng)害防治與新品種推廣。Emai1：1fwazfd@126.com。