羅 軼 丘明明
廣西食品藥品檢驗所,廣西 南寧 530021
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藥物研究
HPLC譜法測定天黃猴棗散中膽紅素的含量
羅軼*丘明明
廣西食品藥品檢驗所,廣西南寧530021
【摘要】目的:建立天黃猴棗散中膽紅素HPLC含量測定方法。方法:采用CAPCELLPAK C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm),以乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液(用三乙胺調節(jié)pH值至6.0)(13∶50∶37)為流動相,檢測波長451nm。結果:膽紅素在0.01931~1.9309μg范圍內呈良好的線性關系;回收率為100.3% ,RSD=2.5%(n=9)。結論:本法專屬性強,簡便快速,精密度良好。
【關鍵詞】膽紅素;含量測定;HPLC;天黃猴棗散
天黃猴棗散具有清心,豁痰,開竅,涼肝,息風,解毒的功效。臨床常用于熱病神昏,中風痰迷,驚厥抽搐,癲癇發(fā)狂,咽喉腫痛,口舌生瘡,癰腫疔瘡。處方中體外培育牛黃為的君藥,而膽紅素為體外培育牛黃主要有效成分之一。據(jù)文獻報道[1],膽紅素是一個直鏈四吡咯化合物,在人體內是血紅素的代謝(分解)產物。藥理研究表明,膽紅素有解熱、降壓、抗病毒、抗衰老、抗癌和促進紅血球新生的作用。選擇膽紅素作為含量測定指標,可反映和控制天黃猴棗散的內在質量。研究采用高效液相色譜法測定天黃猴棗散中膽紅素的含量。
1儀器與材料
1.1儀器美國Agilent高效液相色譜儀(含DAD檢測器、Chemstations色譜工作站);MILLI-PROA純水處理器。
1.2材料膽紅素對照品(批號:100077-200503,中國藥品生物制品檢定所。經歸一化法檢查,純度以膽紅素X Ⅲα、 Ⅸα、 Ⅷα三個異構體峰面積之和計算,為97.72%)。 天黃猴棗散為廣西梧州制藥(集團)股份有限公司和廣州敬修堂(藥業(yè))股份有限公司提供。陰性樣品為廣西梧州制藥(集團)股份有限公司提供。乙腈、甲醇為色譜純,水為高純水,其它試劑均為分析純。
2方法與結果
2.1色譜條件色譜柱:CAPCELLPAK C18柱(250mm×4.6 mm,5μm);流動相:乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液(用三乙胺調節(jié)pH值至6.0)(13∶50∶37);檢測波長:451nm;柱溫30℃;流速1.0 ml/min;進樣量:5μl。在此色譜條件下,并參考相關文獻[2],膽紅素三個異構體出峰順序為X Ⅲα、Ⅸα、 Ⅷα,三個異構體之間能完全分離,且與其他雜質峰有很好的分離。對照品及樣品色譜圖見圖1。
2.2對照品溶液的制備取膽紅素對照品,精密稱定,加二甲基亞砜制成每1ml含20μg的溶液,即得。
2.3供試品溶液的制備取本品適量,混勻,取約50mg,精密稱定,置棕色具塞錐形瓶中,精密加入二甲基亞砜25ml,密塞,稱定重量,超聲處理(功率400W,頻率40KHz)30min,放冷,再稱定重量,用二甲基亞砜補足減失的重量,搖勻,濾過,即得。2.4線性關系考察精密稱取膽紅素對照品9.88mg,置25ml棕色量瓶中,加二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對照品貯備液。精密量取對照品取貯備液0.5、0.5ml,分別置50、20ml棕色量瓶中,再精密量取對照品取貯備液0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0、10ml,分別置10ml棕色量瓶中,加二甲基亞砜稀釋至刻度,搖勻得標準曲線溶液。取5μl上述對照品溶液按“2.1”項下色譜條件測定。以對照品進樣量(μg)為橫坐標,峰面積為縱坐標,進行回歸,得回歸方程Y=6.2204×103X-5.8761,r=1.0000。表明膽紅素在0.01931~1.9309μg范圍內線性關系良好。
2.5精密度試驗取同一供試液,在“2.1”項色譜條件下連續(xù)測定6次,記錄各峰面積,計算RSD,結果6次測定膽紅素平均峰面積RSD=0.6%,表明儀器精密度良好。
2.6重復性試驗取同一批樣品6份,按“2.3”項下的方法制備,按“2.1”項下的色譜條件測定。結果 6份樣品測得膽紅素含量的平均值為11.9323mg/g,RSD=1.1%,結果表明本法的重復性較好。
2.7穩(wěn)定性試驗取同一供試液,按“2.1”項色譜條件分別在0、2、5、7、9、13、18、22、27h測定。結果供試品溶液在9h內峰面積RSD=2.8%,13 h后峰面積RSD=4.2%,27 h后峰面積RSD=5.4%,表明應在9小時內完成膽紅素的測定。
2.8加樣回收率試驗
2.8.1加樣用對照品溶液的制備精密稱取膽紅素對照品10.60mg,置25ml量瓶中,加二甲基亞砜使溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為膽紅素對照品儲備液;精密量取對照品儲備液1.5、3.0、5.0ml,分別置A、B、C三個100ml量瓶中,加二甲基亞砜稀釋至刻度,搖勻,即得
2.8.2加樣回收試驗精密稱取已知含量的天黃猴棗散25mg,共9份,1~3份分別精密加入“2.8.1”項下對照品混合溶液A 25ml,4~6份分別精密加入對照品混合溶液B 25ml,7~9分別精密加入對照品混合溶液C 25ml,按“2.3”項下的方法提取,即得。精密吸取5μl注入液相色譜儀,測定含量,計算回收率,結果見表1。
表1 膽紅素回收率結果
2.9干擾實驗取陰性樣品,按“2.3”項下供試品溶液的制備方法制備,測定,結果陰性樣品在膽紅素峰相應的保留時間處無干擾峰,表明處方中成分對測定無影響。
2.10樣品測定對2個不同生產單位的10批樣品進行膽紅素含量測定,結果含量在9.5~11.6mg/g之間。
3討論
3.1測定成分的選擇參考文獻[3],體外培育牛黃在制備過程中,受生產工藝、酸、堿、光、熱及貯存條件等因素影響,雙吡咯環(huán)產生異構化,即X Ⅲα、Ⅸα、 Ⅷα。膽紅素Ⅸα是天然產物的原型物,故以異構體的總量來控制本品中膽紅素的含量,較為合理。
3.2流動相的選擇參考《中國藥典》和文獻[2],HPLC法測定膽紅素的流動相有三氯甲烷-甲醇-二乙胺(80∶19∶1)、甲醇-三氯甲烷-1%磷酸溶液(80∶14∶6)、乙腈-二甲基亞砜-pH4.7的1%醋酸銨(40∶60∶55)等,考慮到本實驗系反相色譜,三氯甲烷和二甲基亞砜對色譜柱傷害較大,經摸索,最后確定用本文列出的流動相,得到的色譜峰形對稱,分離度好。
3.3提取溶劑的考察天黃猴棗散處方中為體外培育牛黃,其膽紅素為游離型膽紅素,由6個分子內氫鍵形成,為不溶于水的脂溶性化合物,故對二甲基亞砜、三氯甲烷、三氯甲烷-1%鹽酸甲醇溶液(5∶1)、二甲基亞砜-乙腈(7∶3)、EDTA-二氯甲烷(1∶10)等提取溶劑進行考察,結果以二甲基亞砜為溶劑提取效果最好,見表2。
表2 提取溶劑考察結果
3.4提取方法的考察實驗曾對靜置過夜、超聲處理和加熱回流等3種樣品溶液的制備方法進行比較,結果加熱回流得到的供試品,未能檢測到膽紅素,表明加熱后膽紅素被破壞,不宜加熱提??;而超聲處理的含量明顯高于靜置過夜的樣品含量。
3.5膽紅素異構體在空氣中尤其在光照下極易被氧化,因此整個操作因避光進行。穩(wěn)定性實驗結果進一步表明,含量測定操作方法以快速為佳。
參考文獻
[1] 黃泰康.常用中藥成分與藥理手冊[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,1994:557.
[2] 尹華,吳健敏,梁文藻.膽紅素異構體相對含量的RP-HPLC測定[J].藥物分析雜志,1992,12(6):338-339.
[3] Norbert Blanckacrt.Analysis of bilirubin and bilirubin mono and diconjugates[J]. Biochem J, 1980,18(5):115-128.
作者簡介:羅軼(1972-),女,副主任藥師,主要從事中藥質量控制及安全性研究。E-mail:luoyi20010211@163.com
【中圖分類號】R284.1
【文獻標志碼】A
【文章編號】1007-8517(2016)10-0014-02
(收稿日期:2016.03.27)
Content Analysis of Bilirubin in Tianhuang Houzao Powder by HPLC
LUO YiQIU Mingming
Guangxi Institute for Food and Drug Control, Nanning 530021, China
Abstract:Objective To establish a method of determinating content of bilirubin in Tianhuang Houzao Powder by HPLC.Methods A CAPCELLPAK C18(250mm×4.6mm,5 μm)column was used with acetonitril-menthol-0.1%Phosphoric acid solution (adjust pH to 6.0 with triethylamine )(13∶50∶37) as the mobile phase.Detector wavelength was 451nm.Results The linearity was obtained over the range of 0.01931~1.9309μg.The mean recovery was 100.3%,RSD=2.5%(n=9).Conclusion The method was sensitive.simple and accurate.
Key words:Bilirubin;Content determination;HPLC;Tianhuang Houzao powder