張永亮，劉　鵬，駱秀梅，劉　楊

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古 通遼　028042)

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虉草ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化與引物篩選

張永亮，劉鵬，駱秀梅，劉楊

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古 通遼028042)

22個(gè)虉草基因組DNA為ISSR-PCR 擴(kuò)增模板，采用單因素試驗(yàn)方法，對(duì)影響PCR 擴(kuò)增體系中dNTP、引物濃度、Taq酶和模板DNA 用量4個(gè)因素及引物退火溫度進(jìn)行梯度試驗(yàn)，優(yōu)化得到最佳的ISSR-PCR 反應(yīng)體系，即20μL 反應(yīng)體系中分別加入0.3 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL)，2 μL 10×PCR Buffer(mg2+plus)，1.5 μL dNTP (2.5 mmol/L)，1.5 μL引物(10 pmol/μL)，50 ng模板DNA，ddH2O 補(bǔ)足體積。以此體系對(duì)24條引物進(jìn)行篩選，最終獲得了多態(tài)性高，重復(fù)性好的引物12條。引物UBC808、809、811、815、818、820、826的適宜退火溫度為55℃，引物835，841和842 的適宜退火溫度為56℃，而引物810和834 的適且退火溫度分別為52℃和54℃。12條引物共擴(kuò)增總條帶數(shù)192條，其中，多態(tài)性條帶數(shù)173條，多態(tài)位點(diǎn)百分率89.81%。

虉草；ISSR-PCR反應(yīng)體系；引物篩選

虉草(Phalarisarundinacea)，屬于禾本科(Gramineae)、虉草屬植物，別名草蘆、園草蘆。主要分布于歐洲、北美和亞洲，在我國主要分布于東北、華北、華中、華東等地區(qū)。虉草耐鹽堿、耐濕澇，又耐旱，生長快，營養(yǎng)繁殖能力強(qiáng)，產(chǎn)草量高、葉量豐富，蛋白質(zhì)含量高，被廣泛用于飼草、人工濕地植物、生物能源材料或造紙?jiān)系萚1-2]。國內(nèi)有關(guān)虉草的耐鹽性和生產(chǎn)性能已有較多報(bào)道[3-7]，而有關(guān)虉草分子標(biāo)記研究甚少[8]。因此，試驗(yàn)旨在通過研究ISSR-PCR反應(yīng)中各項(xiàng)參數(shù)變化對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，并對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，建立適用于虉草的ISSR反應(yīng)體系，并進(jìn)行ISSR引物篩選，為進(jìn)一步研究虉草種群遺傳多樣性奠定基礎(chǔ)。

ISSR是一種建立在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上的DNA分子標(biāo)記技術(shù)， 由加拿大蒙特利爾大學(xué)的Zietkiewicz 等[9]于1994年創(chuàng)建。ISSR技術(shù)可重復(fù)性強(qiáng)，多態(tài)性更好，而且不需知道被檢測物種任何基因組的信息，因此，ISSR標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性研究[10-12]。ISSR-PCR反應(yīng)結(jié)果主要受到TaqDNA 聚合酶、引物、模板、Mg2+、dNTP等5種因素的影響[13-17]。試驗(yàn)以22個(gè)虉草基因組DNA 為模板，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，通過研究ISSR-PCR 反應(yīng)中各項(xiàng)參數(shù)變化對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，優(yōu)化ISSR-PCR 反應(yīng)體系，篩選出適合虉草ISSR 研究的引物，旨在建立適合虉草的ISSR 反應(yīng)體系，為虉草遺傳多樣性、種質(zhì)資源篩選和分子標(biāo)記輔助育種等方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1供試材料

供試22份虉草材料及其來源見表1。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用花盆培養(yǎng)，待幼苗生長至4～5片葉時(shí)摘取植株頂部以下第2片嫩葉用于基因組DNA的提取。

1.2虉草基因組DNA的提取及檢測

試驗(yàn)采用新型快速植物基因組DNA 提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司，離心柱型)，提取虉草基因組DNA，方法按照說明書進(jìn)行。

用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，取5 μL模板DNA，混合1 μL 6×Loading Buffer，設(shè)標(biāo)準(zhǔn)分子量為DL2000 Marker，緩沖電壓設(shè)為100 V穩(wěn)定電壓(5 v/cm2)，1×TAE緩沖液電泳90 min分離，EB(溴化乙錠)染色。電泳結(jié)果采用凝膠成像系統(tǒng)檢測并記錄。根據(jù)電泳檢測結(jié)果，將符合要求的DNA 溶液分裝于1.5 mL的離心管中，在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　22分不同產(chǎn)地的虉草

注：供試材料1～16號(hào)來源于國家草種質(zhì)資源中期庫

1.3虉草ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

根據(jù)有關(guān)禾本科牧草ISSR分子標(biāo)記相關(guān)文獻(xiàn)[18-22]，從100條ISSR引物中挑選出24條引物(表2)。引物序列由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，dNTP和TaqDNA聚合酶購于TaKaRa公司。

針對(duì)模板DNA濃度、dNTP濃度、引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度(10×PCR Buffer，含2 μL mg2+)等影響因素，利用單因素水平梯度試驗(yàn)對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系中的各個(gè)因素的適宜濃度進(jìn)行單因素梯度試驗(yàn)逐一優(yōu)化。在確定最佳反應(yīng)條件時(shí)，參照文獻(xiàn)[13-17]中的ISSR擴(kuò)增程序和反應(yīng)體系進(jìn)行，對(duì)反應(yīng)體系各因素設(shè)置不同梯度水平(表3)，2 μL 10×PCR Buffer(mg2+plus)，以DL2000作為對(duì)照。當(dāng)試驗(yàn)中對(duì)某一因素進(jìn)行梯度設(shè)置時(shí)，其余因素均保持不變。在最佳反應(yīng)體系確定的基礎(chǔ)上，再進(jìn)一步篩選每一個(gè)引物的最佳退火溫度。

表2　ISSR標(biāo)記的引物

注：* Y =(C，T)

表3　ISSR-PCR反應(yīng)的因素和水平

1.4引物的篩選

根據(jù)確定的ISSR-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序，選取2個(gè)虉草DNA模板對(duì)24條ISSR引物進(jìn)行初步篩選。選取擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶多、信號(hào)強(qiáng)、背景清晰的引物用于后續(xù)的ISSR-PCR反應(yīng)。

1.5PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測和分析

PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后，用預(yù)先制好的濃度為2.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。緩沖電壓設(shè)為90U，1×TAE緩沖液電泳分離，待溴酚藍(lán)遷移至凝膠的2/3處，停止電泳，取出凝膠置于紫外凝膠自動(dòng)成像儀拍照并保存。根據(jù)ISSR-PCR分子標(biāo)記的原理及方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行比較分析，確定最佳虉草ISSR-PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序。

2　結(jié)果與分析

2.1DNA檢測

通過瓊脂糖電泳檢測DNA質(zhì)量，圖1中DNA電泳帶沒有拖尾現(xiàn)象且圖像較為清楚，可知所提DNA純度較高，RNA和蛋白質(zhì)含量較少，符合ISSR-PCR分析要求。

2.2PCR 反應(yīng)體系對(duì)虉草ISSR-PCR擴(kuò)增的影響

2.2.1dNTP濃度對(duì)虉草ISSR-PCR擴(kuò)增的影響dNTP是ISSR-PCR反應(yīng)的原料底物，對(duì)擴(kuò)增條帶有很大的影響。濃度過高會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，濃度太低則擴(kuò)增產(chǎn)物不完全，導(dǎo)致產(chǎn)率下降。試驗(yàn)表明，dNTP添加量為0.5 μL和1.0 μL時(shí)擴(kuò)增條帶較弱； 添加量為1.5 μL時(shí)擴(kuò)增出的條帶最清晰，并且多態(tài)性好(圖2)。但當(dāng)添加量為2.0 μL時(shí)，擴(kuò)增條帶的亮度較1.5 μL時(shí)的擴(kuò)增條帶暗，綜合考慮，選擇1.5 μL作為 ISSR-PCR 反應(yīng)體系中 dNTP 的最佳添加量。

2.2.2模板DNA濃度對(duì)虉草ISSR-PCR擴(kuò)增的影響試驗(yàn)結(jié)果表明DNA 濃度在30和40 ng時(shí)，擴(kuò)增條帶弱，50和60 ng時(shí)條帶比較完整，其中50 ng時(shí)條帶最為清晰(圖3)。綜合考慮，選擇50 ng作為 ISSR-PCR 反應(yīng)體系中模板DNA的最佳濃度。

圖1　22份虉草基因組DNA電泳圖Fig.1　The electrophoresis on Genomic DNA of 22 Phalaris arundinacea materials注：從左到右依次為DL2000Marker、品種代號(hào)1～22號(hào)

圖2　不同dNTP濃度下ISSR-PCR擴(kuò)增Fig.2　Effect of dNTPs concentration on ISSR-PCR amplification注：從左到右依次為DL2000 Marker、0.5、1.0、1.5、2.0 μL

2.2.3引物濃度對(duì)虉草ISSR-PCR擴(kuò)增的影響在不同引物濃度下所擴(kuò)增出的條帶，當(dāng)添加量為0.5 μL 時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物不完全，且條帶清晰度不高。當(dāng)添加量為1.0和1.5 μL時(shí)，反應(yīng)穩(wěn)定，條帶清晰，從擴(kuò)增效果圖中可以看出添加量為1.5 μ條帶更容易辨別(圖4)。當(dāng)添加量為2.0 μL時(shí)，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。綜合分析，選擇1.5 μL作為 ISSR-PCR 反應(yīng)體系中引物的最佳添加量。

2.2.4Taq酶濃度對(duì)虉草ISSR-PCR擴(kuò)增的影響當(dāng)Taq酶用量為0.1 μL和0.2 μL時(shí)合成效率低；用量為0.3 μL和 0.4 μL時(shí)，擴(kuò)增條帶多態(tài)性好并且條帶清晰易分辨(圖5)。結(jié)合整個(gè)試驗(yàn)成本等因素綜合考慮，選用0.3 μL 的Taq酶用量作為ISSR-PCR 反應(yīng)體系中引物的最佳濃度。

圖3　不同DNA濃度下ISSR-PCR擴(kuò)增Fig.3　Effect of template DNA concentration on ISSR-PCR amplification注：從左至右依次為DL2000 Marker、30、40、50、60 ng

圖4　不同引物濃度下ISSR-PCR擴(kuò)增Fig.4　Effect of primer concentration on ISSR-PCR amplification注：從左至右依次為DL2000 Marker、0.5、1.0、1.5、2.0 μL

圖5　不同Taq酶下的ISSR-PCR擴(kuò)增Fig.5　Effect of Taq DNA polymerase concentration on ISSR-PCR amplification注：從左至右依次為DL2000 Marker、0.1、0.2、0.3、0.4 μL

2.3虉草ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系的確定

通過諸多因素的優(yōu)化試驗(yàn)分析，篩選出了虉草的ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系和最適擴(kuò)增程序。反應(yīng)體系為20 μL，其中，TaqDNA聚合酶0.3 μL、10×PCR Buffer 2 μL、dNTP 1.5 μL、模板DNA50 ng、引物1.5 μL、ddH2O 13.7 μL。

2.4最適退火溫度和ISSR-PCR擴(kuò)增程序的確定

根據(jù)上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司推薦的引物退火溫度范圍，對(duì)22份不同產(chǎn)地虉草ISSR-PCR 退火溫度、時(shí)間與循環(huán)次數(shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)表明，引物UBC808、809、811、815、818、820、826適宜退火溫度為

55℃，引物835，841和842適宜退火溫度為56℃，而引物810和834退火溫度分別為52℃和54℃時(shí)才能得到穩(wěn)定、清晰的特異性譜帶。ISSR-PCR擴(kuò)增的程序第1階段，94℃預(yù)變性5 min；第2階段，94℃變性45 s、退火60 s(退火溫度參照所用引物的最適溫度)、72℃延伸120 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；第三階段，72℃延伸10 min。

2.5最佳反應(yīng)體系的驗(yàn)證

運(yùn)用單因素試驗(yàn)所獲得的最佳反應(yīng)體系和最適退火溫度，通過多次驗(yàn)證得出的最適擴(kuò)增程序，隨機(jī)選用引物UBC810、818、826和842對(duì)22份不同產(chǎn)地的虉草材料進(jìn)行 ISSR-PCR 擴(kuò)增(圖6～9 )。結(jié)果表明，4個(gè)供試引物的擴(kuò)增條帶都比較清晰，多態(tài)性較豐富，穩(wěn)定性和重復(fù)性好。表明運(yùn)用單因素試驗(yàn)所獲得的最佳反應(yīng)體系和最適退火溫度可以作為虉草基因組DNA的ISSR-PCR反應(yīng)的最佳優(yōu)化體系。

2.6引物篩選

根據(jù)PCR產(chǎn)物電泳圖，以擴(kuò)增條帶數(shù)及多態(tài)性條帶數(shù)為篩選條件，從24條 ISSR引物中共篩選出12條較適宜虉草分子標(biāo)記的引物(表 4)。這12條引物平均擴(kuò)增總條帶數(shù)16條，平均多態(tài)性條帶數(shù)14.4條，平均多態(tài)百分率89.81%。

圖6　引物UBC810對(duì)22個(gè)不同產(chǎn)地虉草材料的擴(kuò)增Fig.6　UBC810 primer amplification for 22 Phalaris arundinacea materials

圖7　引物UBC818對(duì)22個(gè)不同產(chǎn)地虉草材料的擴(kuò)增Fig.7　UBC818 primer amplification for 22 Phalaris arundinacea materials

圖8　引物UBC826對(duì)22個(gè)不同產(chǎn)地虉草材料的擴(kuò)增結(jié)果Fig.8　UBC826 primer amplification for 22 Phalaris arundinacea materials

圖9　引物UBC842對(duì)22個(gè)不同產(chǎn)地虉草材料的擴(kuò)增結(jié)果Fig.9　UBC842 primer amplification for 22 Phalaris arundinacea materials

引物編號(hào)擴(kuò)增總條帶數(shù)多態(tài)性條帶數(shù)多態(tài)百分率/%UBC8081818100.00UBC809171588.24UBC810161593.75UBC8111515100.00UBC815151280.00UBC818181583.33UBC820171694.12UBC8261414100.00UBC834141285.71UBC83513969.23UBC8411717100.00UBC842181583.33Total192173-Average1614.489.81

3　討論與結(jié)論

ISSR-PCR 反應(yīng)體系主要受Mg2 +、dNTP、模板DNA、引物和Taq酶5個(gè)因素濃度的影響[13-17]。dNTP 是 PCR 擴(kuò)增的原料，對(duì)條帶的擴(kuò)增有很大影響。試驗(yàn)表明，dNTP濃度過低而過早消耗完會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物單鏈化，進(jìn)而在電泳檢測時(shí)出現(xiàn)雜帶，產(chǎn)率下降，擴(kuò)增產(chǎn)物不完全；其濃度過高會(huì)導(dǎo)致PCR產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。試驗(yàn)表明，在20 μL的反應(yīng)體系中，1.5 μL dNTP時(shí)擴(kuò)增效果最好。

TaqDNA聚合酶的種類以及用量直接影響擴(kuò)增反應(yīng)成功與否。TaqDNA 聚合酶受酶活性、耐熱性及反應(yīng)體積等因素的限制，使用量大容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的積累，雜帶過多，還會(huì)造成經(jīng)濟(jì)上的浪費(fèi)。酶含量過低，易造成產(chǎn)物條帶模糊不清晰難以讀帶；擴(kuò)增的帶數(shù)隨聚合酶濃度的增加可而增加。但酶量過高，反而引起PCR擴(kuò)增效果的降低。結(jié)果表明，20 μL的反應(yīng)體系中，TaqDNA 聚合酶為0.3 μL時(shí)擴(kuò)增效果最好。

引物濃度影響ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量和帶型的產(chǎn)生。引物濃度過高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，增加引物二聚體的形成幾率[13]。引物濃度過低則擴(kuò)增出的條帶不完全，不能進(jìn)行有效擴(kuò)增。結(jié)果表明，在20 μL的反應(yīng)體系中，引物為1.5 μL時(shí)擴(kuò)增效果最好。

適宜的模板量是確保獲得特異性擴(kuò)增的要素之一[14]。模板濃度過低，擴(kuò)增條帶將很弱甚至沒有；濃度過高，會(huì)增加非專一擴(kuò)增產(chǎn)物或造成彌散型產(chǎn)物，影響擴(kuò)增重復(fù)性。試驗(yàn)優(yōu)化模板DNA濃度為50 ng。

在ISSR擴(kuò)增中，退火溫度和循環(huán)次數(shù)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果好壞具有明顯影響。退火溫度過低，容易出現(xiàn)背景重，彌散的條帶且擴(kuò)增產(chǎn)物少；退火溫度過高，則引物與模板結(jié)合差，容易造成非特異性擴(kuò)增，產(chǎn)物的豐富度降低[16，23]。試驗(yàn)所選12條引物的退火溫度在52～56℃，不同的引物有其適宜的退火溫度，只有在適宜溫度下才能達(dá)到良好的擴(kuò)增效果。

對(duì)ISSR反應(yīng)影響較大的4個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化，建立了虉草基因組DNA的ISSR-PCR擴(kuò)增最佳反應(yīng)體系。在20 μL反應(yīng)體系中，TaqDNA聚合酶0.3 μL，10×PCR Buffer(mg2+plus) 2 μL，dNTP 1.5 μL，引物1.5 μL，ddH2O 13.7 μL，模板DNA50 ng。虉草ISSR-PCR擴(kuò)增的程序如下：第1階段，94℃預(yù)變性5min；第2階段，94℃變性45 s、退火60 s(退火溫度采用所用引物的最適溫度)、72℃延伸120 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；第3階段，72℃延伸10 min。然后在4℃保存。12條引物共擴(kuò)增總條帶數(shù)192條，其中，多態(tài)性條帶數(shù)173條，多態(tài)位點(diǎn)百分率89.81%。該反應(yīng)體系的建立可為虉草遺傳多樣性分析奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

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Optimization of ISSR-PCR reaction system and primer selection forPhalarisarundinacea

ZHANG Yong-liang， LIU Peng，LUO Xiu-mei,LIU Yang

(InnerMongoliaUniversityforNationalities，Tongliao028042，China)

Genomic DNA extracted from 22Phalarisarundinaceamaterials was used as template for ISSR-PCR to study the impact of dNTPs concentration,template DNA,primer andTaqpolymerase in PCR system by using a single factor experiment method in order to establish the optimized ISSR-PCR reaction system.The results showed that the best reaction system was 2μL 10×PCR Buffer(mg2+plus),1.5μL dNTPs (2.5 mmol/L),1.5μL primer (10 pmol/μL),0.3 μLTaqpolymerase (5 U/μL),50 ng template,and ddH2O to 20μL at last.Base on this PCR system,24 primers were selected,in which,12 primers showed high polymorphism and repeatability.The suitable annealing temperature of primer 808,809,811,815,818,820,826 was 55℃,and it was 56℃ for primer 835,841 and 842,52℃ and 54℃ for primer 810 and 834 respectively.A total of 192 bands were amplified from 12 ISSR primers，in which,173 were polymorphic loci，the average percentage of polymorphic band was 90.62%.The reaction system would provide the basis for the diversity analysis ofPhalarisarundinaceawith ISSR markers.

Phalarisarundinacea;ISSR-PCR reaction system;primer selection

2015-12-16；

2016-01-03

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(2015MS0337)；內(nèi)蒙古民族大學(xué)市校合作項(xiàng)目(SXYB2012077)資助

張永亮(1959-)，男，內(nèi)蒙古包頭人，教授，博士，主要從事牧草栽培與種質(zhì)資源評(píng)價(jià)研究。

E-mail：zyl8802@163.com

S 543；Q 786

A

1009-5500(2016)03-0001-07