許雷來朱星瑜謝璐帆謝小紅

miRNA失控表達在乳腺癌耐藥中的研究進展

許雷來1朱星瑜1謝璐帆1謝小紅2

乳腺癌：化療耐藥；microRNA；失控表達

乳腺癌是世界第二大常見腫瘤，是女性最常見的腫瘤。2012年新發(fā)腫瘤中乳腺癌占25%[1]。化療、內(nèi)分泌治療及靶向治療聯(lián)合的綜合治療是乳腺癌的主要治療方式之一。據(jù)報道，治療過程中約有70%的乳腺癌患者對化療、內(nèi)分泌治療出現(xiàn)耐藥性[2]。無論是原發(fā)耐藥還是繼發(fā)耐藥都會大大影響乳腺癌患者的無病生存時間（disease-free survival，DFS）及總生存時間（overall survival，OS）。microRNA（miRNA）是一種非編碼的小分子RNA，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有證據(jù)表明miRNA在乳腺癌治療藥物敏感性方面有著決定性的調(diào)控作用，其具體機制的探索可為研發(fā)新的治療藥物提供方向[3]。本文對miRNA在乳腺癌耐藥中的研究進展進行綜述。

1 乳腺癌耐藥機制

1.1 藥物轉(zhuǎn)運化療藥物的耐藥機制與藥物轉(zhuǎn)運和代謝的蛋白密切相關(guān)，被稱為ATP結(jié)合盒蛋白家族（ATP-binding cassette，ABC），其主要成員ABCA～ABCG分別調(diào)控12種藥物轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白，包括P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MDR-associated protein 1）。這些蛋白在癌細胞對藥物的吸收、清除中起重要作用。乳腺癌耐藥的患者往往高表達ABC蛋白[4]。

1.2 DNA修復(fù)一般細胞的DNA損傷后細胞周期隨即停滯并進行DNA修復(fù)，待DNA修復(fù)后細胞周期恢復(fù)正常。在腫瘤細胞中，由于細胞周期檢驗點反應(yīng)缺陷，當腫瘤細胞遭受化療藥物損傷時，可通過激活周期檢驗點反應(yīng)阻滯細胞周期進程，加強損傷修復(fù)，導(dǎo)致耐藥表型的產(chǎn)生[5]。

1.3 細胞凋亡許多化療藥物被證明是通過誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用，而這一過程的核心環(huán)節(jié)是胱天蛋白酶（caspases）的活化。死亡受體被激活后促發(fā)了caspase級聯(lián)反應(yīng)，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體（death-inducing signaling complex）觸發(fā)細胞凋亡。整個過程受到腫瘤壞死因子家族（外源性）和Bcl-2家族（內(nèi)源性）的調(diào)控，為腫瘤耐藥的發(fā)生提供可能[6]。

1.4 腫瘤干細胞（CSCs）和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）乳腺癌干細胞（BCSCs）是一群未分化、具有自我更新、多系分化潛能并以CD44+/CD24-為表型的細胞。傳統(tǒng)的化療藥物主要針對增殖旺盛的細胞，而腫瘤干細胞多處于G0期，不合成DNA或進行細胞分裂，因而能夠逃避化療藥物的殺傷而得以存活，存活的干細胞分裂生成祖細胞。一旦化療，祖細胞受周圍環(huán)境中相關(guān)因子的激活進入細胞周期，分裂分化成腫瘤細胞及化療耐藥表型[7]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）即上皮細胞在胚胎發(fā)育過程中或病理狀態(tài)下轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)特點的間葉細胞的現(xiàn)象。有證據(jù)表明EMT與腫瘤干性密切相關(guān)，進一步研究發(fā)現(xiàn)，體外發(fā)生EMT的細胞表現(xiàn)出腫瘤干細胞的特性[8-9]。

2 miRNA功能及生物起源

目前認為miRNA是一個內(nèi)源性19～22號核苷酸長鏈非編碼RNA分子，在基因調(diào)控表達方面起到了巨大的作用[10]。miRNA成熟過程大致概括起來為[11]：（1）通過RNA聚合酶II在不同區(qū)域轉(zhuǎn)錄mRNA基因形成pri-miRNA；（2）經(jīng)過核酸內(nèi)切酶RNaseⅢDrosha及其輔助因子DGCR8的識別和作用后形成60～75nt的miRNA前體（pre-miRNA）；（3）pre-miRNA被細胞質(zhì)中的Dicer酶切割成20～25nt雙鏈的miRNA，我們稱之為miRNA：miRNA*配對分子（miRNA*為miRNA的互補序列）；（4）成熟的miRNA從miRNA：miRNA*配對分子分離，與核糖核酸組合形成沉默誘導(dǎo)復(fù)合體（miRISC），并結(jié)合于靶mRNA而發(fā)揮基因負調(diào)控作用。其主要機制有兩種：（1）對靶mRNA剪切：miRNA與靶mRNA完全互補或幾乎完全互補，miRNA引導(dǎo)Ago-2對靶mRNA進行特異性切割，通常在植物中存在這種機制；（2）對靶mRNA翻譯的阻遏：miRNA與靶mRNA不完全互補，進行不完全互補結(jié)合從而抑制mRNA的翻譯，一般在大多數(shù)動物體內(nèi)存在。比較特別的是在人體中，miRNA不止能在翻譯的起始和延伸階段抑制翻譯過程，而且可以誘導(dǎo)靶mRNAs的脫腺苷化帽子結(jié)構(gòu)的去除和降解。

3 乳腺癌中miRNA失控表達

miRNA根據(jù)其表達水平可分為上調(diào)型和下調(diào)型，也被稱為癌基因和抑癌基因。研究表明，miRNA在乳腺癌的復(fù)發(fā)、侵襲、轉(zhuǎn)移中起到非常重要的作用[12]。miRNA在乳腺癌中不同的表達水平影響著化療藥物的藥效，提示miRNA可作為乳腺癌耐藥的治療靶點，見表1。

表1 乳腺癌耐藥相關(guān)miRNA

4 miRNA參與乳腺癌耐藥機制

4.1 miRNA與ABC轉(zhuǎn)運蛋白

4.1.1 miRNA與P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）P-gp由ABCB1基因編碼，其過表達導(dǎo)致多藥耐藥（MDR）的發(fā)生，并與紫杉烷類及蒽環(huán)類化療藥物耐藥密切相關(guān)[23]。ABCB1啟動子區(qū)的低甲基化及組蛋白修飾的改變造成了ABCB1表達的上升，使得越來越多的乳腺癌細胞發(fā)生耐藥。研究[24]發(fā)現(xiàn)，相比較于常規(guī)MCF-7細胞系，P-gp在多柔比星（DOX）耐藥的乳腺癌細胞系MCF-7/DOX中表達水平更高。對MCF-7/DOX細胞進行miRNA芯片檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-451表達下調(diào)。通過細胞轉(zhuǎn)染miR-451增加其表達后，MCF-7/DOX對DOX的藥物敏感性上升。主要機制可能是通過靶標ABCB1 3’-UTR，導(dǎo)致P-gp蛋白表達下調(diào)。

4.1.2 miRNA與MRP-1多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRPs）屬于ABC跨膜轉(zhuǎn)運蛋白超家族的一個亞組，其成員主要為MRP1-9，分別有ABCC1-9基因編碼[25]。Liang等[18]發(fā)現(xiàn)相比較于VP-16非耐藥MCF-7細胞系，VP-16耐藥MCF-7/VP中MRP1存在過表達。與此同時發(fā)現(xiàn)在MCF-7/VP細胞系中miR-326表達下調(diào)。通過細胞轉(zhuǎn)染miR-326，可明顯抑制MCF-7/VP細胞系中MRP1的表達，增加乳腺癌細胞對VP-16的敏感性，可見miR-326為MRP1的靶標[18]。

4.1.3 miRNA與BCRP乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）屬于ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族的G亞家族成員，是介導(dǎo)MDR的關(guān)鍵蛋白之一，參與多種藥物的吸收、分布和排泄。BRCP具體介導(dǎo)的ATP依賴性泵出化療藥物有米托蒽醌（MX）、拓撲替康、7-乙基-10-羥基喜樹堿（SN-38）[25]。BRCP被發(fā)現(xiàn)在MX耐藥的乳腺癌細胞系MCF-7/MX中表達上調(diào)，同時RT-PCR顯示miR-487a在該細胞系中表達下調(diào)。熒光素酶報告分析結(jié)果顯示miR-487a通過靶標BRCP的mRNA的3’端，下調(diào)BRCP的表達，最終增加MX在細胞中的積累，增加細胞毒性，減少耐藥[19]。

4.2 miRNA與DNA修復(fù)乳腺癌易感基因1（BRCA1）通過調(diào)控同源重組（homologous recombination，HR）修復(fù)DNA損傷，有證據(jù)顯示BRCA1基因突變與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，更進一步的研究發(fā)現(xiàn)，BRCA1蛋白功能的喪失會導(dǎo)致包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生[26]。使用聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase，PARP）抑制劑處理BRCA1突變的乳腺癌細胞后，能顯著導(dǎo)致腫瘤細胞的死亡，此現(xiàn)象被稱之為合成致死性（synthetic lethality）。但在野生型BRCA1細胞中PARP抑制劑無法引起細胞死亡，原因可能是野生型并未喪失同源重組的能力。另外，Sasaki等[13]研究發(fā)現(xiàn)在BRCA1突變的三陰性乳腺癌（TNBC）中，吉西他濱聯(lián)合PARP1能夠抑制乳腺癌細胞的增殖及促進細胞的凋亡。更進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-206在BRCA1突變的TNBC中表達上調(diào)而在野生型中表達明顯降低。miR-206過表達能調(diào)節(jié)細胞周期蛋白D2（cyclin D2）造成細胞周期停滯，導(dǎo)致TNBC耐藥的發(fā)生。由此提示，miR-206調(diào)節(jié)細胞周期的機制在PARP1抑制劑治療野生型BRCA1型乳腺癌起到至關(guān)重要的作用。

4.3 miRNA與細胞凋亡多種miRNA被報道參與到細胞的增殖、凋亡過程[25]。目前紫杉醇+卡鉑（PTX/CBP）化療方案是較為有效的新輔助化療（NAC）方案之一，然而其有效機制尚未明確。研究[20]表明miR-621過表達能夠增加乳腺癌細胞系和異種移植腫瘤中細胞的凋亡，增加化療敏感性。更進一步的研究發(fā)現(xiàn)，miR-621負調(diào)控FBXO11的表達?？梢姡琺iR-621可通過抑制FBXO11的表達，從而促進細胞凋亡，提高化療療效。順鉑因能通過DNA交聯(lián)促進細胞凋亡而被廣泛用于化療。Zhao等[21]發(fā)現(xiàn)，過表達miR-383能夠增加細胞對順鉑的凋亡敏感性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Gadd45g為miR-383的靶基因。過表達Gadd45g能夠逆轉(zhuǎn)miR-383相關(guān)的順鉑敏感性增加?？梢妋iR-383可能通過Gadd45g介導(dǎo)增加化療藥效。

近年來，在藥物引起腫瘤細胞凋亡的研究中，活性氧（reactive oxygen species，ROS）的作用被廣泛關(guān)注。ROS是由細胞發(fā)生氧化磷酸化時產(chǎn)生，在正常細胞內(nèi)維持在穩(wěn)定的范圍。由于腫瘤細胞的抗氧化酶活性相較于正常細胞低，所以清除ROS的能力較正常細胞低，但同時腫瘤細胞產(chǎn)生的ROS卻又往往高于正常細胞。細胞內(nèi)ROS的聚集是一把雙刃劍，ROS的適度升高可促進細胞增殖，而高水平ROS可介導(dǎo)凋亡因子Bax的活化，促進細胞凋亡[27]。Serguienko等[28]發(fā)現(xiàn)在let-7a轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細胞系中，DOX發(fā)揮強大的抗腫瘤功能，明顯高于未轉(zhuǎn)染的細胞系。然而，轉(zhuǎn)染細胞系經(jīng)過抗氧化劑N-乙酰基-半胱氨酸（N-acetyl-cysteine）處理后，DOX抑制細胞增殖能力明顯下降?？梢妉et-7a在上調(diào)ROS方面具有重大意義。

4.4 miRNA與EMT多項研究證實化療藥物可能引起細胞發(fā)生EMT，導(dǎo)致乳腺癌細胞耐藥。TGF-β通過誘導(dǎo)EMT在多種腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用。Bai等[22]通過體外藥物誘導(dǎo)方法建立乳腺癌赫賽汀耐藥（TR）細胞株。通過miRNA芯片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)miR-200c在TR細胞株中表達下調(diào)。對于野生型細胞株，使用miR-200c抑制劑處理后。MTT實驗結(jié)果顯示野生型細胞株對赫賽汀產(chǎn)生耐藥。更進一步研究發(fā)現(xiàn)，TR細胞轉(zhuǎn)染miR-200c可以降低TR細胞TGF-βmRNA水平與TGF-β信號通路激活水平。研究還發(fā)現(xiàn)，miR-200c的直接靶向轉(zhuǎn)錄抑制因子（ZEB1）與轉(zhuǎn)錄激活因子鋅指蛋白（ZNF217），調(diào)控TGF-β信號通路的激活水平。敲除ZNF217和ZEB1后的TR細胞株對赫賽汀的耐藥性明顯降低。Yang等[14]發(fā)現(xiàn)在紫杉醇耐藥的細胞株中，下調(diào)miR-125b的表達能夠使細胞表現(xiàn)出間充質(zhì)細胞的特征，而過表達miR-125b后，細胞表現(xiàn)出反間充質(zhì)細胞特征并且對紫杉醇的敏感性增加。

4.5 miRNA與乳腺癌干細胞目前，乳腺癌干細胞（BCSC）與乳腺癌耐藥相關(guān)已得到普遍證實。多柔比星耐藥株MCF-7/DOX中被證實具有大量的BC SC[29]。Park等[15]在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)MCF-7/DOX中miR-34a表達水平降低，但其靶基因NOTCH1表達上調(diào)?；謴?fù)細胞中miR-34a的表達，能夠降低細胞對多柔比星的耐藥性。對轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞株進行腫瘤干細胞的miRNA表達譜分析，結(jié)果提示miR-7低表達的細胞更容易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移。更進一步的研究發(fā)現(xiàn)，miR-7能夠通過降低靶基因KLF4 mRNA水平來抑制乳腺癌干細胞自我更新，從根本上降低了乳腺癌干細胞轉(zhuǎn)移、侵襲的可能性。提示miR-7可能作為干細胞型乳腺癌耐藥的治療靶點[29]。

5 miRNA與乳腺癌耐藥的防治

5.1 miRNA與乳腺癌耐藥預(yù)測研究表明，miRNA具有預(yù)測乳腺癌耐藥的潛力，但如何快速、簡便的提取miRNA是一個大難題。既往對miRNA的研究都局限于細胞內(nèi)的活動。Lawrie等[30]發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNA能在血清中穩(wěn)定存在，并且表達程度與彌散性B細胞淋巴瘤患者的存活率呈負相關(guān)，這為臨床上miRNA簡便檢測提供可能。更進一步的研究發(fā)現(xiàn)，1mL血漿中即可提供足夠miRNA用于檢測，并且可用于判斷是正常組織還是腫瘤組織。這些研究充分說明外周血中miRNA表達譜的檢測可在將來作為一項常規(guī)檢查用于乳腺癌的治療。

5.2 miRNA與乳腺癌耐藥的治療盡管諸多體內(nèi)外研究[31-32]提示miRNA用于抗癌治療具有較好的應(yīng)用前景，但到目前為止仍是一個巨大的挑戰(zhàn)。為了避免miRNA藥物在體內(nèi)的快速降解和排泄，尋找一種能穩(wěn)定將藥物送至靶組織的新的藥物轉(zhuǎn)運載體是必要的。近年研究表明，納米材料可作為新型藥物載體，其具有高度靶向定位的優(yōu)勢，顯著提高藥物的利用率，減少藥物用量，并且能實現(xiàn)對藥物的釋放控制。另外，以納米顆粒作為藥物載體還能降低藥物對靶向位置的副作用，減小對其他非靶器官的毒性作用，并且成本較其他方法更低廉[33-34]。Ekin等[35]已成功運用納米金作為載體，將miR-145寡核苷酸成功載入乳腺癌細胞株中。

6 展望

越來越多的研究證實miRNA與乳腺癌耐藥密切相關(guān)。改變?nèi)橄侔┘毎衜iRNA原有的表達水平可以增強細胞對化療藥物的敏感性。此外，由于乳腺癌具有不同的分子亞型，臨床上亟需一個miRNA分子譜，用于臨床乳腺癌患者耐藥預(yù)測，使患者最大化的從化療中獲益。隨著miRNA對乳腺癌耐藥機制研究的不斷深入及miRNA相關(guān)藥物載體的研制，相信在未來基于miRNA的靶向藥物能夠用于乳腺癌的治療，獲得顯著的療效。

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（收購：2015-12-17 修回：2016-02-20）

浙江省自然科學(xué)基金資助項目（No.LY12H16008）；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃暨新苗人才計劃（No.2015R410026）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)（杭州310053）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科（杭州310006）

謝小紅，E-mail：xxh666857@163.com