高鴻山宋堃高煥萍

真武膠囊聯(lián)合苯那普利治療擴(kuò)張性心肌病實(shí)驗(yàn)研究

高鴻山1宋堃2高煥萍1

目的觀察真武膠囊聯(lián)合苯那普利治療大鼠擴(kuò)張性心肌病療效。方法32只2周齡Wistar雄性大鼠喂養(yǎng)呋喃唑酮8周，建立擴(kuò)張性心肌病動物模型。造模成功后，隨機(jī)等分為真武膠囊組、苯那普利組、聯(lián)合組及模型對照組，每組8只，分別予灌胃真武膠囊[1.8g/（kg·d）]、苯那普利[3.33mg/（kg·d）]及真武膠囊聯(lián)合苯那普利，模型對照組不干預(yù)，正常喂養(yǎng)。8周后超聲測量大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑（LVDD）、收縮末期內(nèi)徑（LVSD）、射血分?jǐn)?shù)（LVEF）；檢測各組大鼠心肌膠原含量、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，顯微鏡下觀察心肌結(jié)構(gòu)。結(jié)果（1）大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑（LVDD）：真武膠囊組（0.57±0.05）cm，苯那普利組（0.56±0.10）cm，聯(lián)合組（0.51±0.11）cm，均較模型對照組（0.67± 0.03）cm明顯縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；（2）大鼠左心室收縮末期內(nèi)徑（LVSD）：真武膠囊組（0.34±0.12）cm，苯那普利組（0.35±0.06）cm，聯(lián)合組（0.31±0.04）cm，均小于模型對照組的（0.42± 0.01）cm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；（3）射血分?jǐn)?shù)：真武膠囊組（59.3±2.1）%，苯那普利組（60.2± 2.3）%，聯(lián)合組（68.3±1.2）%，均高于模型對照組的（36.1±1.1）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。聯(lián)合組LVDD、LVSD及射血分?jǐn)?shù)均優(yōu)于真武膠囊組與苯那普利組（P＜0.05）。（4）大鼠心肌膠原含量：真武膠囊組（8.33±1.2）μg/mgprot，苯那普利組（8.22±2.1）μg/mgprot，聯(lián)合組（6.34±1.1）μg/mgprot，均小于模型對照組的（10.45±2.2）μg/mgprot；（5）心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)：真武膠囊組10.6±2.1，苯那普利組10.4±1.5，聯(lián)合組8.2±1.4，均低于模型對照組的17.9±2.1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。聯(lián)合組較真武膠囊組和苯那普利組減少（P＜0.05）。鏡下觀察，模型對照組大鼠心肌纖維排列紊亂，纖維結(jié)締組織增生明顯。聯(lián)合組大鼠心肌纖維排列整齊，纖維結(jié)締組織增生改善明顯，優(yōu)于真武膠囊組及苯那普利組。結(jié)論真武膠囊聯(lián)合苯那普利能明顯縮小大鼠擴(kuò)大的心臟，提高射血分?jǐn)?shù)，減少心肌膠原含量，抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌重構(gòu)。

大鼠；擴(kuò)張性心肌病；真武膠囊；苯那普利

擴(kuò)張性心肌?。―CM）以心臟擴(kuò)大，心肌收縮力降低為主要特征，臨床治療效果不理想，預(yù)后差。本研究觀察真武膠囊聯(lián)合苯那普利對擴(kuò)張性心肌病模型大鼠的治療效果，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物選取2周齡，Wistar健康雄性大鼠32只，體質(zhì)量（70.3±5.1）g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供，合格證號：SCXK（魯）20110003。飼養(yǎng)環(huán)境符合國家標(biāo)準(zhǔn)（GB14925-94）

1.2 藥物真武膠囊處方：附子、茯苓、白芍各9g，白術(shù)6g，生姜9g，黃芪12g，丹參、降香各10g；加水煎煮兩次，第一次1h，第二次0.5h，濾過后，上清液濃縮成2g/mL流浸膏，將其干燥制成粉末，裝入膠囊。苯那普利片（商品名：洛丁新，北京諾華制藥有限公司，H20000292）；呋喃唑酮（成都市前江制藥廠，H51020009）。

1.3 主要儀器及試劑GE-VIVDE7彩超，探頭頻率10MHz（美國GE公司）；萊卡輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（2135型德國萊卡公司）；顯微鏡（BX60日本OLYMPUS）；TUNEL檢測細(xì)胞凋亡試劑盒（德國BM公司）；羥脯氨酸試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模及分組參照文獻(xiàn)[1]方法，呋喃唑酮、羧甲基纖維素鈉，配成2g/mL溶液，按0.2g/g體質(zhì)量灌胃，1天1次，每周按體質(zhì)量調(diào)節(jié)用藥劑量，共8周。造模后，將32只大鼠隨機(jī)等分為真武膠囊組、苯那普利組、聯(lián)合組及模型對照組，每組8只，分別給予灌胃真武膠囊[1.8g/（kg·d）]、苯那普利[3.33mg/（kg· d）]及真武膠囊聯(lián)合苯那普利（劑量同上）；模型對照組不干預(yù)，正常喂養(yǎng)。8周后進(jìn)行指標(biāo)檢測。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 心臟超聲檢測10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，去胸毛后，連續(xù)測量3個(gè)心動周期的左室舒張末期內(nèi)徑（LVDD）、收縮末期內(nèi)徑（LVSD）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），取其平均值。

2.2.2 心肌膠原含量測定處死大鼠后，取部分左心室，剪碎，在玻璃勻漿管中制備組織勻漿，遵照試劑盒說明操作。通過測量膠原中羥脯氨酸含量推算膠原含量。

2.2.3 光學(xué)顯微鏡下觀察心肌結(jié)構(gòu)切取部分心尖組織置于4%多聚甲醛液固定24h，脫水、石蠟包埋。供光學(xué)顯微鏡檢查及細(xì)胞凋亡檢測。

2.2.4 細(xì)胞凋亡檢測采用原位末端標(biāo)記法檢測心肌細(xì)胞凋亡，將石蠟包埋心肌組織進(jìn)行切片，按照試劑盒說明操作。結(jié)果判定：200倍視野下，每個(gè)切片取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)10個(gè)視野的凋亡細(xì)胞數(shù)，取其平均值作為凋亡細(xì)胞的陽性指數(shù)（AI）。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用方差分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠心臟超聲檢測情況各用藥組左室舒張期及收縮期內(nèi)徑較模型對照組明顯縮小，射血分?jǐn)?shù)明顯提高（P＜0.05）；聯(lián)合組改善最明顯，優(yōu)于真武膠囊組及苯那普利組（P＜0.05），真武膠囊組及苯那普利組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

3.2 各組大鼠心肌膠原含量比較各用藥組心肌膠原含量較模型對照組明顯減少（P＜0.05）；聯(lián)合組減少優(yōu)于真武膠囊組及苯那普利組（P＜0.05）；真武膠囊組和苯那普利組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表1 各組大鼠LVDD、LVSD、LVEF比較（）

表1 各組大鼠LVDD、LVSD、LVEF比較（）

注：與模型對照組比較，*P＜0.05；與聯(lián)合組比較，#P＜0.05；LVDD：左室舒張末期內(nèi)徑；LVSD：左室收縮末期內(nèi)徑；LVEF：左室射血分?jǐn)?shù)

組別真武膠囊組苯那普利組聯(lián)合組模型對照組只數(shù)8 8 8 8 LVDD（cm）0.57±0.05*#0.56±0.10*#0.51±0.11* 0.67±0.03 LVSD（cm）0.34±0.12*#0.35±0.06*#0.31±0.04* 0.42±0.01 LVEF（%）59.3±2.1*#60.2±2.3*#68.3±1.2* 36.1±1.1

3.3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較模型對照組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)升高，各用藥組凋亡指數(shù)組較模型對照組明顯降低（P＜0.05）；聯(lián)合組優(yōu)于真武膠囊組及苯那普利組（P＜0.05）；真武膠囊組和苯那普利組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠心肌膠原含量及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（）

表2 各組大鼠心肌膠原含量及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（）

注：與模型對照組比較，*P＜0.05，與聯(lián)合組比較，#P＜0.05

組別真武膠囊組苯那普利組聯(lián)合組模型對照組只數(shù)8 8 8 8膠原含量（μg/mgprot）8.33±1.2*#8.22±2.1*#6.34±1.1* 10.45±2.2凋亡指數(shù)10.6±2.1*#10.4±1.5*#8.2±1.4* 17.9±2.1

3.4 各組大鼠光學(xué)顯微鏡下心肌結(jié)構(gòu)變化模型對照組大鼠心肌纖維排列紊亂，纖維結(jié)締組織增生明顯。真武膠囊組及苯那普利組心肌纖維排列尚整齊，纖維結(jié)締組織輕度增生。真武膠囊聯(lián)合苯那普利組心肌纖維排列整齊，纖維結(jié)締組織增生改善情況明顯優(yōu)于真武膠囊組及苯那普利組，見圖1（封二）。

4 討論

擴(kuò)張性心肌病臨床主要表現(xiàn)為胸悶氣急，活動性喘憋，甚至端坐呼吸。屬中醫(yī)“胸痹”、“心痛”范疇。多屬本虛標(biāo)實(shí)之證，病因病機(jī)以脾腎陽虛，心陽不振，水氣內(nèi)停，瘀血阻滯為主，病位主要在心，涉及脾腎[2]。治療多以溫陽利水，益氣活血為組方原則。真武膠囊由溫陽利水的真武湯輔以益氣、活血中藥組成。方中君藥附子溫腎暖土，以助陽氣；臣以茯苓甘淡滲利，以利水邪；生姜辛溫，既助附子溫陽祛寒，又伍茯苓溫散水氣；佐以白術(shù)健脾燥濕，扶脾運(yùn)化，白芍緩急和中。又加黃芪以益氣養(yǎng)心、利水消腫，加丹參、降香活血化瘀。藥理[3]研究顯示，黃芪能保護(hù)受損心肌細(xì)胞，抑制心肌纖維化，降低凋亡基因。實(shí)驗(yàn)研究顯示[4]，丹參對缺血缺氧心肌有保護(hù)作用，能改善心功能，降低心肌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以溫陽利水、益氣活血為組方原則的真武膠囊能縮小擴(kuò)大的心臟，提高射血分?jǐn)?shù)，降低膠原含量，抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌重構(gòu)。

擴(kuò)張性心肌病病理學(xué)改變以心肌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外間質(zhì)纖維化為主。隨著心肌細(xì)胞凋亡，心肌纖維化加劇，細(xì)胞外間質(zhì)膠原含量或容積分?jǐn)?shù)明顯增高[5]。心肌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外間質(zhì)纖維重構(gòu)導(dǎo)致心肌變薄、心臟擴(kuò)大，繼而引起血流動力學(xué)紊亂。腎素-血管緊張素活性升高，特別是血漿中AngⅡ活性的升高,是心肌重構(gòu)的重要因素[6]。Pu等[7]描述了在試驗(yàn)大鼠的心肌細(xì)胞中AngⅡ誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)。ACEI在一定程度上減少AngⅡ的生成，從而防止由AngⅡ誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡及心肌重構(gòu)，為本實(shí)驗(yàn)采用ACEI類藥物苯那普利提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，苯那普利抑制了細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)，與以上文獻(xiàn)報(bào)道一致。

本研究顯示，真武膠囊及苯那普利均能縮小擴(kuò)大的心臟，提高射血分?jǐn)?shù)，降低心肌膠原含量，抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌重構(gòu)，兩者聯(lián)合應(yīng)用效果更顯著，明顯優(yōu)于兩個(gè)單藥組治療效果（P＜0.05）。

［1］丁永，鐘家蓉，白永虹，等．呋喃唑酮誘導(dǎo)大鼠擴(kuò)張型心肌病模型的實(shí)驗(yàn)研究［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，32（7）：718-721.

［2］彭雁，陳彥，彭正林．賈秀蘭主任醫(yī)師治療擴(kuò)張性心肌病的臨床經(jīng)驗(yàn)［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2008，29（12）：16-17.

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［4］李雪蓮，關(guān)會林，王璐，等．丹參酮IIA調(diào)節(jié)microRNA-1保護(hù)缺氧心肌細(xì)胞的作用研究［J］．現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，14（28）：5463-5467．

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（收稿：2015-11-27修回：2016-02-24）

Effect of Zhenwu Capsule Combined with Benazepril on Dilated Cardiomyopathy in Rats

GAO Hongshan1, SONG Kun2,GAO Huanping1.1 Department of Critical Care Medicine,the Central Hospital of Zaozhuang Mining Group,Zaozhuang(277000),China;2 Department of Geriatrics,Zaozhuang Chinese Medical Hospital,Zaozhuang (277000),China

ObjectiveTo investigate the effect of Zhenwu capsule combined with benazepril on dilated cardiomyopathy（DCM）in rats.MethodsThirty-two male Wistar rats（2 weeks old）were fed with furazolidone for 8 weeks to establish DCM model,then were randomly and equally divided into 4 groups：Zhenwu capsule group,benazepril group,Zhenwu capsule combined with benazepril group,and control group.Rats were given Zhenwu capsule[1.8g/（kg·d）],benazepril[3.33mg/（kg·d）]and Zhenwu capsule combined with benazepril by gavage in 3 treatment groups,respectively,while rats in control group were fed normally in absence of intervention.After 8 weeks, all rats were measured on left ventricular end-diastolic diameter（LVDD）,left ventricular end-systolic diameter（LVSD）and left ventricular ejection fraction（LVEF）by color doppler ultrasound,then were sacrificedto detect cardiac collagen contents,measure apoptosis index and observe themicrostructure of myocardium by microscope. ResultsThe LVDD was 0.57±0.05cm in Zhenwu capsule group,0.56±0.10cm in benazepril group,and 0.51± 0.11cm in Zhenwu capsule combined with benazepril group,which were all higher than that in control group（0.67±0.03cm,P＜0.05）.The LVSD was 0.34±0.12cm,0.35±0.06cm,0.31±0.04cm in Zhenwu capsule group,benazepril group,and Zhenwu capsule combined with benazepril group,repectively,which were all lower than that in control group（0.42±0.01cm,P＜0.05）.The LVEF was higher in 3 treatment groups than that in control group（59.3%± 2.1%,60.2%±2.3%,68.3%±1.2%vs 36.1%±1.1%,P＜0.05）.The collagen content and myocardial apoptosis index were both lower in 3 treatment groups than that in control group（collagen：8.33±1.20μg/mgprot,8.22±2.1μg/mgprot, 6.34±1.10μg/mgprot vs 10.45±2.2μg/mgprot;myocardial apoptosis index：10.6±2.11,10.4±1.5,8.2±1.4 vs17.9±2.1; all P＜0.05）;a significant difference in myocardial apoptosis index was also found between combined drugs group and single drug groups（P＜0.05）.The cardiac fibrosis arranged in disorder and was significant proliferated in control group.Zhenwu capsule combined with benazepril improved the disorder and attenuated the proliferation of myocardial fibrosis,which was better than the effect in Zhenwu capsule and benazepri single drug groups.Conclusion Zhenwu capsule combined with benazepril can obviously reduce enlarged heart,enhance ejection fraction,lower collagen content,inhibit myocardial apoptosis,and improve myocardial remodeling.

rats;dilated cardiomyopathy;Zhenwu capsule;benazepril

1山東省棗莊礦業(yè)集團(tuán)中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（棗莊277000）；2山東省棗莊市中醫(yī)醫(yī)院老年病科（棗莊277000）

高鴻山，Tel：13589607545；E-mail：13589607545@163.com