屈騰飛，張小桐，曹嫚嫚，周鐵忠，柴文戌，屈禹城，王春華，陳磊，米成軍，王輝暖?

遼寧地區(qū)貂源銅綠假單胞菌分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

屈騰飛1，張小桐1，曹嫚嫚1，周鐵忠1，柴文戌2，屈禹城1，王春華1，陳磊3，米成軍4，王輝暖1?

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院。遼寧錦州121001；3.遼寧省興城市藥王動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧興城125127；4.山東省臨沂市蘭山區(qū)畜牧獸醫(yī)局，山東臨沂267004）

為了解遼寧地區(qū)水貂銅綠假單胞菌的流行狀況及耐藥情況，對(duì)從遼寧地區(qū)暴發(fā)出血性肺炎養(yǎng)貂場(chǎng)分離的16株分離菌進(jìn)行了分離純化、生化鑒定、基因鑒定、血清學(xué)分型和藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示，分離株包括G型和B型兩種血清型，其中G型是主要流行血清型，占分離株的75%，其余是B型。分離株對(duì)阿米卡星、頭孢呋肟、阿莫西林和亞胺培南的敏感率較高，對(duì)氨芐青霉素的敏感率中等，對(duì)氯霉素、氨曲南和左氟沙星具有一定的耐藥性。

水貂；銅綠假單胞菌；分離；鑒定；藥敏試驗(yàn)；血清型

水貂出血性肺炎又稱(chēng)水貂假單胞菌肺炎，是由銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA），俗稱(chēng)綠膿桿菌引起的急性、敗血性傳染病，是一類(lèi)人畜共患的條件致病菌，在水貂以出血性肺炎為主要特征，發(fā)病急，死亡快，常呈地方性暴發(fā)流行，給養(yǎng)貂業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]，該病自1953年丹麥的Knox首次報(bào)道以來(lái)[2]，相繼在瑞典、芬蘭、美國(guó)、法國(guó)和日本被報(bào)道，1979年我國(guó)的劉凱[3]對(duì)該病做了首次報(bào)道，隨后在國(guó)內(nèi)陸續(xù)出現(xiàn)[4-5]。近幾年隨著養(yǎng)貂業(yè)快速發(fā)展，養(yǎng)殖密度增加，尤其是在炎熱潮濕的夏秋季節(jié)，水貂出血性肺炎已呈暴發(fā)性流行，成為嚴(yán)重危害水貂養(yǎng)殖的重要傳染病。由于引起水貂出血性肺炎的銅綠假單胞菌血清型較多，并且不同血清型之間幾乎沒(méi)有交叉感染保護(hù)或者交叉保護(hù)力低，同時(shí)銅綠假單胞菌又具有極強(qiáng)的耐藥性[6]，而目前國(guó)內(nèi)缺少正式上市的水貂出血性肺炎疫苗，因此本研究對(duì)采自遼寧各地的水貂出血性肺炎的病料進(jìn)行分離、基因鑒定、血清學(xué)分型并進(jìn)行了耐藥試驗(yàn)，以了解遼寧省水貂銅綠假單胞菌的流行特點(diǎn)、耐藥性，為臨床治療和研制疫苗預(yù)防該病提供理論依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 病料和菌株采集2013～2014年遼寧省大連市、盤(pán)錦市、營(yíng)口市、錦州市、葫蘆島市等地暴發(fā)出血性肺炎貂場(chǎng)的病貂，銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27583本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑十六烷三甲基溴化胺瓊脂培養(yǎng)基（NAC）（購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）、藥敏試紙（購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限責(zé)任公司）、2×PCR TaqMix、DNA提取試劑盒、膠回收與純化試劑盒（購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司）、綠膿桿菌血清分型用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清（日本生研株式會(huì)社）。

1.3 細(xì)菌分離純化無(wú)菌條件下打開(kāi)病貂的肺臟接種于NAC瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16～24 h，待長(zhǎng)出單個(gè)菌落，進(jìn)行革蘭氏染色和菌落形態(tài)觀察，同時(shí)挑取單菌落進(jìn)行連續(xù)純化培養(yǎng)，直到顯微鏡檢查為單一細(xì)菌，將純培養(yǎng)物接種于LB瓊脂糖培養(yǎng)管進(jìn)行增菌備用，同時(shí)接種于NAC瓊脂平板觀察培養(yǎng)特性。

1.4 基因鑒定取1.5 mL菌液按照試劑盒的說(shuō)明提取分離菌株的DNA，以細(xì)菌的16S rRNA為目標(biāo)基因進(jìn)行PCR鑒定，引物采用27F和1 492 r通用引物，見(jiàn)表1[7]，反應(yīng)體系為30μL，其中PCR模板2μL，2×PCR TaqMix 15μL，上下游引物各1μL，去離子水10μL；PCR反應(yīng)條件：94℃5 min，30個(gè)循環(huán)，94℃45 s，55℃45 s，72℃45 s，72℃10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，然后凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。結(jié)果為目的片段后，膠回收純化PCR產(chǎn)物并送上海生工生物技術(shù)有限公司序列測(cè)定，序列利用Blast與已知序列進(jìn)行對(duì)比，確定所分離菌株的種屬。

1.5 血清型鑒定根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行操作。

1.6 藥敏試驗(yàn)按照CLSI 2009版銅綠假單胞菌K-B法標(biāo)準(zhǔn)操作程序和判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2 結(jié)果和分析

2.1 細(xì)菌分離純化共分離得到16份菌株，全部能夠在NAC培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落呈圓形、微隆起、扁平、濕潤(rùn)、大小不一，有水溶性綠色或褐色色素產(chǎn)生，革蘭氏染色為陰性?xún)啥蒜g圓的短桿菌，單個(gè)或者成雙排列。

2.2 基因鑒定將PCR產(chǎn)物凝膠電泳后，在1 500 bp附近可見(jiàn)清晰的目的條帶（見(jiàn)圖1），膠回收后對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，16株分離株16S rRNA片段長(zhǎng)度1 438 bp左右。在NCBI上通過(guò)Blast對(duì)序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)分離株序列與銅綠假單胞菌的同源性到達(dá)99%，同源性達(dá)到97%以上視為同種水平，因此，進(jìn)一步確認(rèn)分離的菌株為銅綠假單胞菌屬的銅綠假單胞菌。

2.3 血清型鑒定經(jīng)玻板凝集試驗(yàn)鑒定，16株銅綠假單胞菌的血清型見(jiàn)表2，可見(jiàn)在遼寧地區(qū)G型和B型是水貂銅綠假單胞菌的主要流行菌株，其中G型占的比例最高，達(dá)到75%，；其次是B型占25%，其余血清型未檢出。

圖1 16株分離菌株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR result of 16 isolated strains

表2 16株銅綠假單胞菌血清型鑒定結(jié)果Table2 Serotyping result of 16 strains

2.4 藥敏試驗(yàn)銅綠假單胞菌分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，可見(jiàn)分離株對(duì)阿米卡星、頭孢呋肟、阿莫西林和亞胺培南四種藥物的敏感率較高，分別為88%、75%、69%和66%，而耐藥性較低。對(duì)氨芐青霉素的敏感率中等，而對(duì)氯霉素、左氟沙星和氨曲南具有一定的耐藥性，其中對(duì)氯霉素的耐藥性最高達(dá)到75%，其余兩種的耐藥性為44%和50%。

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)銅綠假單胞菌選擇培養(yǎng)基和16S rRNA的基因鑒定，確認(rèn)從多個(gè)水貂出血性肺炎的肺臟中分離的菌株為銅綠假單胞菌，表明銅綠假單胞菌是導(dǎo)致水貂暴發(fā)出血性肺炎的重要病原菌之一。隨著水貂出血性肺炎的頻繁暴發(fā)，以及對(duì)養(yǎng)貂業(yè)造成的危害程度，需要獲得該病原菌的病原學(xué)、流行病學(xué)詳細(xì)資料，以期能夠提出有效的防治策略，保障水貂養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，而目前對(duì)銅綠假單胞菌主要針對(duì)的是人源銅綠假單胞菌的研究，尤其是人源銅綠假單胞菌耐藥機(jī)理的研究，而對(duì)貂源銅綠假單胞菌的研究資料相對(duì)較少，因此開(kāi)展更多貂源銅綠假單胞菌的相關(guān)研究工作很有必要。

表3 16株銅綠假單胞菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table3 Results on drug sensitivity test of 16 strains

本次血清型的鑒定結(jié)果與閆新武等[9]報(bào)道的相同，與其他學(xué)者報(bào)道的基本相同，只是比例稍有差異外，以及他們還鑒定出少量的其他血清型，比如I型[8，10-12]、C型[6，12-13]、E型[6]、D型和F型[12]，但都以G型為主要血清型，由于不同血清之間沒(méi)有交叉保護(hù)或者交叉保護(hù)力低[6]，這就需要研制能夠包含所有血清型的疫苗才能起到很好的保護(hù)作用。

銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，主要包括青霉素結(jié)合蛋白的突變、外膜蛋白缺乏、產(chǎn)生鈍化酶以及泵的主動(dòng)外排等，其耐藥性受多個(gè)系統(tǒng)參與調(diào)控。本次的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，由于分離株對(duì)氨芐青霉素（6%）、氯霉素（6%）、左氟沙星（19%）和氨曲南（6%）的敏感率低于20%，因此不建議在臨床上使用這些藥物治療銅綠假單胞菌的感染。而在抗銅綠假單胞菌的藥物中抗菌活性最高的是阿米卡星，這也是本次藥敏試驗(yàn)中唯一一個(gè)敏感率超過(guò)80%的藥物（88%），潘德芹[14]對(duì)2010年3月～2014年2月118株臨床分離的貂源銅綠假單胞菌藥敏試驗(yàn)顯示阿米卡星的敏感率為72%，白雪等[8]檢測(cè)2002～2010年間從國(guó)內(nèi)5個(gè)省水貂養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)出血性肺炎的水貂肺中分離獲得45株綠膿桿菌對(duì)阿米卡星的敏感率為78%，其他學(xué)者的檢測(cè)結(jié)果也表明貂源銅綠假單胞菌對(duì)阿米卡星是敏感的，耐藥率低[9，15-16]，該結(jié)果與人源銅綠假單胞菌耐藥性試驗(yàn)的調(diào)查相同。陳越等[17]對(duì)2012年中國(guó)不同地區(qū)7 270株銅綠假單胞菌臨床分離株的耐藥性調(diào)查顯示，在檢測(cè)的12種臨床常用抗菌藥物中銅綠假單胞菌對(duì)阿米卡星的耐藥率最低，為13.5%，同時(shí)也是敏感率最高的藥物達(dá)到82.3%，而隨后張祎博等[18]對(duì)國(guó)內(nèi)19家醫(yī)院2005～2014年臨床分離的銅綠假單胞菌耐藥性調(diào)查顯示10年間銅綠假單胞菌對(duì)阿米卡星敏感率一直是最高的，原因可能是銅綠假單胞菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)修飾酶介導(dǎo)的耐藥存在底物特異性，高度耐藥較少；同時(shí)臨床上該類(lèi)藥物較其他類(lèi)抗菌藥物少。但孫娜等[19]對(duì)山東某貂場(chǎng)分離的5株銅綠假單胞菌藥敏分析發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)阿米卡星耐藥，這是新的耐藥趨勢(shì)還是其他原因引起的值得進(jìn)一步的研究。由于銅綠假單胞菌的耐藥性高，耐藥機(jī)制復(fù)雜，使用單一抗菌藥物治療易產(chǎn)生耐藥，因此建議在臨床上治療銅綠假單胞菌引起的疾病，一方面堅(jiān)持聯(lián)合用藥、規(guī)范用藥，另一方面應(yīng)加強(qiáng)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果及時(shí)調(diào)整合適的抗菌藥物。

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Identification and Drug Sensitivity Testof Pseudomonas Aeruginosa from Mink

Qu Tengfei1,Zhang Xiaotong1,Cao Manman1,Zhou Tiezhong1,Chai Wenxu2, Qu Yucheng1,Wang Chunhua1,Chen Lei3,Mi Chengjun4,Wang Huinuan1*
(1.College of Animal Husbandry&Veterinary,Jinzhou Medical University,Liaoning Jinzhou 121001; 2.The First Affiliated Hospital,Jinzhou Medical University,Liaoning Jinzhou 121001; 3.Xingcheng Animal Health Supervision Institute,Liaoning Xingcheng 125127; 4.Lanshan of Linyi City Animal Husbandry&Veterinary Bureau,Shandong Linyi 267004)

To investigate the epidemic characteristics and drug resistance of pseudomonas aeruginosa(PA)from minks in Liaoning province,16 bacterial isolated from minks with hemorrhagic pneumonia were identified and characterized by biochemical test,gene,serotypes and drug sensitivity test.Result showed that all 16 isolates were identified as PA by biochemical test and gene.Serogroup G and serogroup B were identified in all isolated strains.Serogroup G was the major serotype,75%of the isolates,The rest is serogroup B.Isolates were high sensitive to amikacin,cefuroxime,amoxicillin and imipenem,moderate sensitivity to ampicillin,and has high resistance to chloramphenicol,aztreonam and levofloxacin.This showed that pseudomonas aeruginosa from mink were multidrug resistance.

Mink;Pseudomonas aeruginosa;Separation;Identification;Drug sensitivity test; Serotype

S852.61

B

1672-9692(2016)11-0001-04

2016-09-15

屈騰飛（1994-），男，河南周口人，本科在讀，從事動(dòng)植物檢疫工作。

王輝暖（1974-），男，山東威海人，博士，講師。

2014年省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410160036）、遼寧省自然科學(xué)基金（2015020779）。