王宇婷，常敬偉，李超，馬莉莉，周玉龍，倪宏波

豬混合感染牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、藍(lán)耳病病毒和大腸桿菌的診斷

王宇婷，常敬偉，李超，馬莉莉，周玉龍，倪宏波?

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319）

牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）不僅感染奶牛和黃牛，還會(huì)感染豬、鹿和羊等多種動(dòng)物。豬感染BVDV會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似于豬瘟的臨床癥狀和病理變化。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)黑龍江大慶市某豬場(chǎng)送檢的病豬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，確診該病豬為牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病病毒和大腸桿菌混合感染。

牛病毒性腹瀉病毒；豬瘟病毒；豬藍(lán)耳病毒；大腸桿菌；混合感染

牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）屬于黃病毒科瘟病毒屬，與豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）和羊邊界病病毒（border disease virus，BDV）同為瘟病毒屬，三者病毒上血清學(xué)存在交叉反應(yīng)[1]。CSFV和BVDV均可感染豬，豬感染CSFV會(huì)引起高熱和敗血癥等致病性癥狀[2]。而豬感染BVDV表現(xiàn)出的癥狀與慢性豬瘟類(lèi)似，CSFV與BVDV之間還存在交叉感染的情況。豬藍(lán)耳病也稱(chēng)為豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive an-drespiratory syndrome，PRRS），該病主要引起豬的繁殖障礙和呼吸道癥狀，PRRSV感染豬后會(huì)導(dǎo)致免疫抑制，造成潛在感染其他病原體，從而給豬場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。豬大腸桿菌（Escherichia coli，E.Coli）病在臨床上主要表現(xiàn)為仔豬黃痢、仔豬白痢和豬水腫病等，該病具有較高的發(fā)病率和死亡率[4]。本文對(duì)黑龍江大慶市某豬場(chǎng)發(fā)病的保育豬，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室診斷，確診為牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和大腸桿菌混合感染，診斷結(jié)果報(bào)告如下[5]。

1 發(fā)病情況

2016年5月，黑龍江省大慶市某豬場(chǎng)保育仔豬出現(xiàn)腹瀉，生長(zhǎng)遲緩，發(fā)病率高，死亡率10%～20%，用多種抗生素治療效果不佳。豬群曾接種過(guò)細(xì)胞源豬瘟活疫苗，但未完全控制疫情。

2 臨床癥狀

保育豬體溫升高、精神沉郁、食欲減退，消瘦、腹瀉，生長(zhǎng)緩慢，腹部膨脹，雙耳發(fā)藍(lán)發(fā)紺，體表有針尖狀出血點(diǎn)，尤其是腹部皮膚和四肢。

3 剖檢變化

經(jīng)剖檢病豬，可見(jiàn)喉頭有出血點(diǎn)；頜下淋巴結(jié)腫大，周邊有出血點(diǎn)，切面呈大理石樣；彌漫性間質(zhì)性肺炎；脾邊緣出血性梗死；胃黏膜出血；腸道卡他性炎癥，腸系膜淋巴結(jié)充血腫大。

4 細(xì)菌分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

無(wú)菌采取豬的肝臟、脾臟和肺臟和腸內(nèi)容物按常規(guī)方法分別接種于5%兔血營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。次日，5%兔血營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，但在麥康凱培養(yǎng)基上長(zhǎng)出桃紅色、圓形和邊緣整齊的菌落，通過(guò)鏡檢和生化試驗(yàn)確定為大腸桿菌[6]。將分離到的大腸桿菌進(jìn)行致病性試驗(yàn)，小白鼠24 h內(nèi)死亡，說(shuō)明其具有較強(qiáng)致病性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，鹽酸頭孢喹肟和多黏菌素B對(duì)大腸桿菌敏感。

5 PCR檢測(cè)

5.1 引物設(shè)計(jì)和合成CSFV和PRRSV特異性檢測(cè)引物由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，BVDV特異性檢測(cè)引物參照參考文獻(xiàn)[7]，引物序列如表1所示，引物由上海生物工程技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

表1 引物序列Table1 Primer squence

5.2 樣品的處理與病毒基因組的提取將無(wú)菌采集的脾、肺和下頜淋巴結(jié)等病料混合加入4 mL的DEPC水，充分研磨均勻，吸取研磨好的液體，加入到無(wú)RNA酶的EP管內(nèi)。根據(jù)病毒基因組RNA試劑盒（購(gòu)自北京博凌科為生物科技有限公司）使用說(shuō)明的操作方法提取組織病料的病毒基因組RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用（購(gòu)自賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司）。

5.3 PCR PCR的擴(kuò)增與檢測(cè)以反轉(zhuǎn)的病毒基因組cDNA為模板，進(jìn)行CSFV、BVDV、PRRSV的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：Buffer 2.5μL、MgCl22μL、dNTP 2μL、上下游引物各1μL、模板1μL、加水至25μL。BVDV、CSFV、HPRRSV和PRRSV的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃3 min 30 s預(yù)變性；94℃35 s變性；72℃40 s延伸，72℃6 min終延伸，30個(gè)循環(huán)，退火40 s，溫度分別是56、57、55和51℃。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖1和圖2所示，CSFV擴(kuò)增產(chǎn)物位于599 bp大小處均可見(jiàn)特異性條帶，與目的基因相符；HPRRSV和PRRSV PCR擴(kuò)增產(chǎn)物位于420 bp和 372 bp大小處均可見(jiàn)特異性條帶，與目的基因相符；BVDV PCR擴(kuò)增產(chǎn)物位于288 bp大小處均可見(jiàn)特異性條帶，與目的基因相符。

圖1 CSFV和PRRS PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The result of CSFV and PRRS PCR

圖2 BVDV PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The result of BVDV PCR

5.4 核酸序列鑒定將臨床組織病料的BVDV陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收（試劑盒購(gòu)自上海百賽生物技術(shù)有限公司）與pMD-18T連接后，選取陽(yáng)性菌送往哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果應(yīng)用Blast在線(xiàn)軟件GenBank中登錄的序列進(jìn)行比較分析表明，BVDV陽(yáng)性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物彼此間序列完全一致，其與GenBank中登錄的BVDV毒株序列（KF006975.1）同源性達(dá)97%。

6 診斷結(jié)論

經(jīng)豬場(chǎng)發(fā)病情況、臨床癥狀和病理剖檢變化等臨床診斷，以及細(xì)菌分離培養(yǎng)、PCR檢測(cè)、核酸序列鑒定等實(shí)驗(yàn)室診斷方法確定，該豬場(chǎng)混合感染牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和大腸桿菌。

7 討論

豬感染BVDV主要途徑為豬免疫接種BVDV污染豬用疫苗及接觸到BVDV感染牛羊和BVDV污染的飼料兩種途徑。豬接觸感染BVDV的牛和羊，采食污染BVDV的飼料，飼喂BVDV污染的牛奶或牛羊內(nèi)臟以及用污染BVDV的飼養(yǎng)工具等都可引起豬感染BVDV。報(bào)道顯示，可在接觸到接種BVDV疫苗牛的豬體內(nèi)檢測(cè)到BVDV抗體[8]。

本病例中的臨床組織樣品檢測(cè)結(jié)果為牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病毒和大腸桿菌混合感染。該豬場(chǎng)免疫接種過(guò)豬瘟疫苗，但未能完全控制疫情。其原因可能為BVDV的感染可對(duì)豬瘟活疫苗的免疫產(chǎn)生干擾作用，其在抑制豬瘟抗體產(chǎn)生的同時(shí)，也刺激機(jī)體產(chǎn)生BVDV的抗體，從而導(dǎo)致豬瘟免疫失敗。BVDV在一定程度上干擾豬瘟活疫苗的免疫效果，影響CSFV抗體水平。牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒和豬藍(lán)耳病毒均具有免疫抑制特性，導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，容易混合感染大腸桿菌，并且前期報(bào)道過(guò)大腸桿菌對(duì)常用抗菌藥物耐藥的發(fā)展越來(lái)越令人擔(dān)憂(yōu)[9]。

一般認(rèn)為豬感染BVDV主要原因是豬使用了被BVDV污染的生物制品，尤其是豬瘟疫苗，這給豬瘟的預(yù)防控制及凈化帶來(lái)了新的困難與挑戰(zhàn)。因此，預(yù)防控制BVDV在豬群的感染，要加強(qiáng)生物試劑的生產(chǎn)和安全管理，從源頭上遏制BVDV污染的可能性，加強(qiáng)對(duì)豬群中BVDV的監(jiān)測(cè)，及時(shí)淘汰陽(yáng)性感染豬，這些應(yīng)引起廣大獸醫(yī)工作者重視。

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Diagnosis ofthe combined infection bovine viraldiarrhea virus,
classicalswine fever virus,Porcine reproductive an-drespiratory syndrome virus and E.coilin pigs

Wang Yuting,Chang Jingwei,Li Chao,Ma Lili,Zhou Yulong,Ni Hongbo*
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University,Heilongjiang Daqing 163319）

Bovine viral diarrhea virus(BVDV)not only infected cows and cattle,but also infected pigs,sheep,deer and other animals.Pigs infected with BVDV occurs clinical symptoms and pathological changes similar to classical swine fever.In this study of a farm in Daqing City in Heilongjiang infected of pigs for laboratory diagnosis,confirmed that pigs as bovine viral diarrhea virus,classical swine fever virus,porcine reproductive an-drespiratory syndrome virus and Escherichia coli combined infection.

Bovine viral diarrhea virus;Classical swine fever virus;Porcine reproductive an-drespiratory syndrome virus;Escherichia coli;Combined infection

S858.23

B

1672-9692(2016)11-0033-04

2016-09-11

王宇婷（1992-），女，在讀碩士研究生，研究方向：獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)。

倪宏波（1972-），男，教授，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)。