張慧然，徐金升，郭利萍，白亞玲，張勝雷，張俊霞，崔立文

胞外pH值通過BMP-2信號通路影響高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化

張慧然，徐金升△，郭利萍，白亞玲，張勝雷，張俊霞，崔立文

摘要：目的探討不同pH值環(huán)境下骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）信號通路對高磷誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）鈣化的影響。方法選取5～8周齡健康雄性SD大鼠，體外分離培養(yǎng)大鼠胸主動脈VSMCs，取第4代VSMCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)正常對照組、pH7.4+高磷組、pH7.1+高磷組和pH7.7+高磷組。采用茜素紅染色及鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法檢測細(xì)胞鈣化情況，酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞堿性磷酸酶（AKP）活性，用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測BMP-2、Smad1及Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）mRNA的表達(dá)。結(jié)果與正常對照組相比，pH7.4+高磷組大鼠VSMCs的鈣含量增加、茜素紅染色鈣化結(jié)節(jié)增多，BMP-2、Smad1、Runx2 mRNA表達(dá)及AKP活性均增高（均P< 0.05）；與pH7.4+高磷組相比，pH7.1+高磷組大鼠VSMCs的鈣含量減低、茜素紅染色鈣化結(jié)節(jié)減少，BMP-2、Smad1、Runx2 mRNA表達(dá)及AKP活性均降低（均P<0.05），pH7.7+高磷組大鼠VSMCs的鈣含量增加、茜素紅染色鈣化結(jié)節(jié)增多，BMP-2、Smad1、Runx2 mRNA表達(dá)及AKP活性均增高（均P<0.05）。結(jié)論胞外酸性環(huán)境（pH7.1）抑制高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs鈣化，胞外堿性環(huán)境（pH7.7）促進(jìn)高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs鈣化，其機(jī)制可能是通過BMP-2信號通路介導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)化。

關(guān)鍵詞：肌細(xì)胞,平滑??；氫離子濃度；骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)類；血管鈣化；pH；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2信號通路

基金項(xiàng)目：河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（H2012206157）

作者單位：河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腎內(nèi)科（郵編050011）

作者簡介：張慧然（1978），女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事慢性腎臟病血管鈣化方面研究

△

通訊作者E-mail:xjs5766@126.com

終末期腎臟?。╡nd-stage renal disease，ESRD）患者死亡的首要病因是心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）［1］。血管鈣化的存在及其嚴(yán)重程度是ESRD患者CVD死亡率及全因死亡率的獨(dú)立預(yù)測因子［2］。ESRD患者血管鈣化主要發(fā)生在中膜，血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）表型轉(zhuǎn)化是血管中膜鈣化的主要機(jī)制之一。有研究表明，胞外酸堿環(huán)境（pH值）對VSMCs鈣化有一定影響，即酸性環(huán)境抑制VSMCs鈣化，堿性環(huán)境促進(jìn)VSMCs鈣化［3-4］，但是胞外不同pH值對VSMCs鈣化的具體作用機(jī)制尚不明確。為此，本研究以高磷誘導(dǎo)大鼠VSMCs鈣化模型，觀察胞外不同pH值環(huán)境對VSMCs鈣化的影響。

1　材料與方法

1.1材料 （1）動物與試劑。選取5～8周齡清潔級健康雄性SD大鼠6只，體質(zhì)量80～100 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證標(biāo)號：1305090。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）；β-甘油磷酸（美國Sigma公司）；SP免疫組化試劑盒（上海博海生物工程開發(fā)有限公司）；鈣測定試劑盒（鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法，中生北控生物科技股份有限公司）；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（上海博海生物工程）；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Therom公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；堿性磷酸酶（AKP）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；PCR引物（上海英濰捷基公司）。（2）儀器與設(shè)備。倒置相差顯微鏡（LH50A型，日本OLYMPUS公司）；酶標(biāo)儀（美國Biotek公司）；PCR儀（美國ABI公司）；酸度計(jì)（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1大鼠VSMCs原代培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組隨機(jī)抽取2只大鼠，采用2%戊巴比妥鈉麻醉后用75%乙醇浸泡，在無菌條件下分離出胸主動脈，剝?nèi)ネ饽?，縱向剪開管壁，然后用紗布輕輕擦除內(nèi)膜，將中膜剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的小塊，加入含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后更換新鮮培養(yǎng)基。此后每隔2～3 d換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況，直至細(xì)胞接近80%～90%融合時(shí)進(jìn)行傳代。此后每隔3～4 d傳代1次，取第4代VSMCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對照組、pH7.4+高磷組、pH7.1+高磷組和pH7.7+高磷組。正常對照組采用含10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，調(diào)整pH值為7.4；pH7.4+高磷組、pH7.1+高磷組和pH7.7+高磷組采用高磷培養(yǎng)基（10 mmol/L β-甘油磷酸+10%胎牛血清）培養(yǎng)，分別將培養(yǎng)基pH值調(diào)整為7.4、7.1和7.7，使用1 mol/L HCl和7.4%NaHCO3調(diào)整培養(yǎng)基pH值，每天換液1次。將剩余4只大鼠按照上述方法培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.2細(xì)胞鑒定VSMCs的鑒別方法同本課題組前期實(shí)驗(yàn)［5］。

1.2.3細(xì)胞鈣化檢測 （1）茜素紅染色。取3代細(xì)胞以5× 104/孔密度接種于12孔板內(nèi)，實(shí)驗(yàn)每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，各實(shí)驗(yàn)組給予不同處理因素14 d后，用細(xì)胞茜素紅鈣染色試劑對樣本進(jìn)行固定、染色及澄清處理，倒置顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)染色情況，每樣本隨機(jī)讀取1個(gè)視野（×100）。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：鈣鹽沉積為橘紅色。（2）測定細(xì)胞內(nèi)鈣含量取3代細(xì)胞以5× 104/孔密度接種于12孔板內(nèi)，實(shí)驗(yàn)每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，各實(shí)驗(yàn)組給予不同處理因素14 d后，細(xì)胞用鹽酸脫鈣取上清，鈣測定試劑盒測定鈣含量，脫鈣后的細(xì)胞用0.1 mol/L NaOH和0.1%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解30 min，BCA法測定細(xì)胞蛋白含量，結(jié)果用細(xì)胞鈣含量比蛋白含量表示（mg/g蛋白）。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附法測定細(xì)胞AKP活性取3代細(xì)胞以5×104/孔密度接種于12孔板內(nèi)，實(shí)驗(yàn)每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，各實(shí)驗(yàn)組給予不同處理因素14 d后，每孔加入200 μL 0.1% Triton X-100置4℃環(huán)境中24 h，然后反復(fù)吹打裂解細(xì)胞后置于離心管中離心，以1 000 r/min離心5 min，取上清液按試劑盒說明書進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀520 nm波長處測定吸光度值，BCA法測定細(xì)胞蛋白含量，結(jié)果用蛋白校準(zhǔn)（U/g蛋白）。

1.2.5反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）測定Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）、Smad1 mRNA的表達(dá)取4代細(xì)胞，各實(shí)驗(yàn)組給予不同處理因素4 d后，采用RNA分離試劑盒，Trizol提取并純化總RNA。PCR反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5 min；95℃30 s，55℃30 s，58℃45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。取PCR產(chǎn)物，行瓊脂糖凝膠電泳。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以GAPDH作為內(nèi)對照，計(jì)算相對含量。各基因擴(kuò)增引物序列見表1。 Tab.1A list of primers used in the reactions

表1　各目的基因引物序列

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，pH7.4+高磷組與正常對照組比較采用t檢驗(yàn)，不同pH值+高磷組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不同pH值對高磷誘導(dǎo)大鼠VSMCs鈣化的影響茜素紅染色結(jié)果顯示，與正常對照組相比，pH7.4+高磷組的橘紅色礦化結(jié)節(jié)明顯增多；與pH7.4+高磷組相比，pH7.1+高磷組的橘紅色礦化結(jié)節(jié)明顯減少，pH7.7+高磷組的橘紅色礦化結(jié)節(jié)明顯增多，見圖1。鈣含量測定結(jié)果與茜素紅染色結(jié)果基本一致，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

1：正常對照組；2：pH7.4+高磷組；3：pH7.1+高磷組；4：pH7.7+高磷組；橘紅色結(jié)節(jié)為鈣化結(jié)節(jié)Fig.1　Alizarin red staining of VSMCs in different goups（×100）圖1　各組大鼠VSMCs茜素紅染色（×100）

Tab.2　Calcium content and activity of AKP in different goups表2各組大鼠VSMCs鈣含量及AKP活性的比較（n=9，±s）

Tab.2　Calcium content and activity of AKP in different goups表2各組大鼠VSMCs鈣含量及AKP活性的比較（n=9，±s）

P＜0.05；t為pH7.4+高磷組與正常對照組比較，F(xiàn)為不同pH值高磷組間比較，其中b與pH 7.4+高磷組比較，c與pH 7.1+高磷組比較，P<0.05

組別正常對照組pH7.4+高磷組pH7.1+高磷組pH7.7+高磷組鈣含量（mg/g蛋白）21.24±3.70 88.69±8.15 68.15±7.27b106.77±7.69bc7.045＊64.527＊AKP活性（U/g蛋白）22.84±3.98 98.50±7.25 56.72±3.98b150.72±7.15bc5.019＊94.385＊t F

2.2不同pH值對高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs AKP活性的影響與正常對照組相比，pH7.4+高磷組AKP活性明顯增強(qiáng)（P<0.05）；與pH7.4+高磷組相比，pH7.1+高磷組AKP活性明顯減弱，pH7.7+高磷組AKP活性明顯增強(qiáng)（P<0.05），見表2。

2.3不同pH值對高磷誘導(dǎo)大鼠VSMCs中BMP-2、Smad1和Runx2 mRNA表達(dá)的影響與正常對照組相比，pH7.4+高磷組BMP-2、Smad1和Runx2 mRNA表達(dá)水平明顯增強(qiáng)（P<0.05）；與pH 7.4+高磷組相比，pH7.1+高磷組BMP-2、Smad1和Runx2 mRNA表達(dá)水平明顯減弱，pH7.7+高磷組BMP-2、Smad1和Runx2 mRNA表達(dá)水平明顯增強(qiáng)（P< 0.05），見圖2。

3　討論

血管鈣化在ESRD患者中普遍存在，主要表現(xiàn)為血管中膜鈣化，而VSMCs是組成血管中膜的主要成分，是血管中膜發(fā)生鈣化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［6-8］。高磷血癥在ESRD患者中很常見，是血管鈣化，特別是中膜鈣化的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子［9］。ESRD患者通常合并不同程度的代謝性酸中毒，而隨著透析的干預(yù)，酸中毒被糾正，pH值逐漸升高，但不同pH值環(huán)境對血管鈣化的影響尚未明確。據(jù)報(bào)道，當(dāng)pH值從7.4降至6.9時(shí)，羥磷灰石中鈣和磷酸鹽的溶解度分別增加2和4倍［10］。酸性環(huán)境抑制了羥磷灰石的產(chǎn)生及其在軟組織的沉積。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)人體內(nèi)環(huán)境pH值，以pH<7.4為酸性環(huán)境，pH>7.4為堿性環(huán)境，以高磷誘導(dǎo)大鼠VSMCs鈣化模型，經(jīng)茜素紅染色和鈣含量測定結(jié)果顯示，pH7.4+高磷可以誘導(dǎo)VSMCs發(fā)生鈣化，而當(dāng)pH值降至7.1時(shí)鈣化減弱，pH值升至7.7時(shí)鈣化加重，提示胞外酸性環(huán)境（pH7.1）可抑制VSMCs發(fā)生鈣化，胞外堿性環(huán)境（pH7.7）可促進(jìn)VSMCs發(fā)生鈣化。

Fig.2　Target gene expressions of VSMCs in different groups detected by RT-PCR圖2RT-PCR檢測各組大鼠VSMCs目的基因表達(dá)情況

近年對血管鈣化的細(xì)胞分子機(jī)制研究表明，血管鈣化是主動的、可預(yù)防、可逆轉(zhuǎn)和高度可調(diào)控的類成骨過程，其中VSMCs的成骨/成軟骨樣表型轉(zhuǎn)化起著關(guān)鍵作用。Runx2是VSMCs成骨/成軟骨樣表型轉(zhuǎn)化的核心轉(zhuǎn)錄因子［11］。AKP是VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的早期標(biāo)志物，其在正常的VSMCs中活性水平較低，但在鈣化的VSMCs中活性水平明顯增高［12］。為了證實(shí)不同pH值是否與VSMCs表型轉(zhuǎn)化直接相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)檢測了大鼠VSMCs中Runx2 mRNA表達(dá)及AKP活性，結(jié)果顯示，pH7.4+高磷上調(diào)了Runx2 mRNA表達(dá)及AKP活性，而當(dāng)pH值降至7.1時(shí)這一過程被減弱，pH值升至7.7時(shí)這一過程被增強(qiáng)，提示胞外酸性環(huán)境（pH7.1）抑制了VSMCs表型轉(zhuǎn)化，胞外堿性環(huán)境（pH7.7）促進(jìn)了VSMCs表型轉(zhuǎn)化。

BMP-2信號通路在VSMCs表型轉(zhuǎn)化中起著關(guān)鍵性的作用［13］。BMP-2與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合從而磷酸化下游的Smad1/5/8，活化的Smad1/5/8與Smad4形成復(fù)合物轉(zhuǎn)入胞核內(nèi)，與不同的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合，引起下游靶基因的轉(zhuǎn)錄［14］。復(fù)合物轉(zhuǎn)入胞核內(nèi)可上調(diào)Runx2、Osterix（OSX）和同源盒基因（Msx）等基因，促進(jìn)成骨分化。BMP-2信號通路還可以上調(diào)AKP、Ⅰ型膠原（collagen type I，Col I）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白（osteoprontin，OPN）和骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）等成骨特異性標(biāo)志物的表達(dá)［15］。為進(jìn)一步研究BMP-2信號通路在不同pH值影響VSMCs成骨/成軟骨樣表型轉(zhuǎn)化中的作用，本實(shí)驗(yàn)檢測了BMP-2 mRNA和BMP-2信號通路效應(yīng)基因Smad1 mRNA表達(dá)：與正常對照組相比，pH7.4+高磷組VSMCs BMP-2 mRNA及其下游的Smad1 mRNA的表達(dá)均升高；與pH7.4+高磷組相比，pH7.1+高磷組BMP-2、Smad1 mRNA的表達(dá)均降低，pH7.7+高磷組BMP-2、Smad1 mRNA的表達(dá)均升高，提示BMP-2信號通路參與了不同pH值影響VSMCs成骨/成軟骨樣表型轉(zhuǎn)化的過程。

綜上所述，BMP-2信號通路參與了不同pH值影響的高磷誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)化及鈣化過程。胞外酸性環(huán)境（pH7.1）可下調(diào)BMP-2信號通路相關(guān)基因的表達(dá)，抑制VSMCs成骨/成軟骨樣表型轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為Runx2表達(dá)減少、AKP活性降低，進(jìn)而抑制VSMCs鈣化；而胞外堿性環(huán)境（pH7.7）對VSMCs鈣化的作用與上述過程相反。上述結(jié)果為進(jìn)一步研究體內(nèi)酸性及堿性環(huán)境對VSMCs鈣化的影響提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（2015-08-18收稿2016-03-18修回）

（本文編輯陳麗潔）

中圖分類號：R692.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.11958/20150117

Extracelluar pH values influence high-phosphorus-induced VSMCs calcification mediated by BMP-2 signaling pathway

ZHANG Huiran,XU Jinsheng△,GUO Liping,BAI Yaling,ZHANG Shenglei,ZHANG Junxia,CUI Liwen Department of Nephrology,the Forth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China
△Corresponding AuthorE-mail：xjs5766@126.com

Abstract：ObjectiveTo explore the effect of different pH values on calcification of rat vascular smooth muscle cells (VSMCs)through bone morphogenetic protein(BMP)-2 signaling pathway.MethodsHealthy male SD rats aged 5-8 weeks were selected in the study.VSMCs from rat thoracic aorta were cultured in vitro,and then identified by immunocytochemistry. The VSMCs were randomly divided into 4 groups by random sampling method:normal group(pH 7.4),pH7.4+high phosphorus group,pH 7.1+high phosphorus group,and pH 7.7+high phosphorus group.Calcium deposition and alkaline phosphatase(AKP) activity were measured by alizarin red staining and enzyme linked immunosorbent assay.The expressions of BMP-2,Smad1 and Runx2 mRNA were detected by RT-PCR.ResultsCompared with the control group,the calcification staining was increased in pH 7.4+high phosphorus group,calcium content was increased and expressions of BMP-2,Smad1,Runx2 mRNA and AKP activity were also increased(P<0.05).While compared with the pH 7.4+high phosphorus group,calcification staining,calcium content,expressions of BMP-2,Smad1,Runx2 mRNA and AKP activity were decreased in pH 7.1+high phosphorus group(P< 0.05).The calcification staining,calcium content,expressions of BMP-2,Smad1,Runx2 mRNA and AKP activity were increased in pH 7.7+high phosphorus group(P<0.05).ConclusionThe extracellular acidic environment(pH 7.1)can inhibit highphosphotus-induced VSMCs calcification,whereas extracellular alkaline environment(pH 7.7)induce high-phosphotus-induced VSMCs calcification.The mechanism is presumably that VSMCs calcification is induced by influencing BMP-2 pathway,which may be mediated by VSMCs phenotype transdifferentiation of BMP-2 signaling pathway.

Key words:myocytes,smooth muscle;hydrogen-ion concentration;bone morphogenetic proteins;vascular calcification; pH;BMP-2 signaling pathway