朱晟易，童鈺鈴，趙奕，呂海鵬，林智，沈國麗，孫婷，宋震亞*

普洱茶對非酒精性脂肪肝大鼠腸道脂肪吸收及粘膜屏障的干預(yù)研究

朱晟易1，童鈺鈴1，趙奕1，呂海鵬2，林智2，沈國麗1，孫婷1，宋震亞1*

1. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310009；2. 農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008

摘要：研究了普洱茶調(diào)控非酒精性脂肪肝大鼠腸道對長鏈脂肪酸的吸收，并探討了其可能機制。將 36只 SD大鼠隨機分成正常對照組、脂肪肝模型組和普洱茶干預(yù)組，每組12只。實驗第8周末處死所有大鼠，測定大鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)及血清血脂水平；采用定量 PCR測定大鼠腸道黏膜脂質(zhì)吸收相關(guān)蛋白細胞分化抗原 36 （Cluster of differentiation 36，CD36）、緊密連接相關(guān)蛋白如閉鎖蛋白（Occludin）、緊密連接蛋白（Zonula occludens 1，ZO-1）和腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-α， TNF-α）基因表達水平。研究結(jié)果表明，與模型組相比，普洱茶組大鼠體質(zhì)量和血清 LDL-C水平分別下降了 16.12%和 42.59%；此外，普洱茶組大鼠小腸組織CD36、TNF-α表達水平明顯降低，而Occludin、ZO-1表達水平明顯升高。研究發(fā)現(xiàn)，普洱茶對NAFLD大鼠腸道長鏈脂肪酸吸收及腸道緊密連接蛋白有一定程度的調(diào)控作用，尤其是對NAFLD早期發(fā)生發(fā)展中游離脂肪酸過度沉積的“第一次打擊”有防治價值。

關(guān)鍵詞：普洱茶；非酒精性脂肪性肝?。恢|(zhì)代謝；緊密連接

非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種除外酒精因素或其他明確病理原因?qū)е碌囊愿螌嵸|(zhì)細胞脂質(zhì)過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征［1］，為全球重要的肝病，也是中國第二大肝病，同時與肥胖、心腦血管疾病、糖尿病等的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。在NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程中，過多游離脂肪酸沉積是“一次打擊”；蓄積的游離脂肪酸通過反應(yīng)性氧化物對肝臟進行“二次打擊”，促使肝臟單純性脂肪肝向非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化發(fā)展［2］。采用非藥物手段改善早期肝臟脂質(zhì)沉積是NAFLD防治工作中極其重要的一環(huán)。

腸道作為食物吸收的主要器官，在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中可能起到重要的作用。脂肪消化后的主要成分中長鏈脂肪酸（Long chain fatty acids，LCFA）的吸收與小腸吸收細胞膜蛋白脂肪酸轉(zhuǎn)位酶細胞分化抗原 36 （Cluster of differentiation 36，CD36）密切相關(guān)［3］。另有研究顯示，NAFLD患者存在小腸粘膜上皮細胞緊密連接結(jié)構(gòu)受損，腸道緊密連接蛋白（Tight junction proteins，TJPs）Occludin 和 ZO-1表達下調(diào)［4］，而上皮細胞 TNF-α表達水平上升［5］的現(xiàn)象，表明可能因為腸粘膜屏障功能減弱使更多細菌內(nèi)毒素進入血液循環(huán)，通過一系列炎癥反應(yīng)造成肝細胞損傷［6］。

茶葉是一種保健飲品，科學(xué)研究已經(jīng)證實它在促進脂肪代謝、減輕體質(zhì)量，以及減肥成功后的體質(zhì)量維持等多方面均有良好的表現(xiàn)［7-10］。普洱茶是一種具有獨特風(fēng)味的微生物發(fā)酵茶，關(guān)于普洱茶的功效備受關(guān)注［11-12］。研究表明，普洱茶能在降低SD大鼠血液中的LDL-C水平的同時提高 SD大鼠血液中的HDL-C水平，而綠茶、紅茶以及烏龍茶等只能同時降低二者的水平［13］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，普洱茶能夠改善NAFLD大鼠肝臟脂肪變性［14］。然而，目前尚無關(guān)于普洱茶對NAFLD腸道影響的研究報道。因此，本實驗擬通過對大鼠體質(zhì)量、肝濕重及血清血脂水平的變化，以及腸粘膜CD36、Occludin、ZO-1 和 TNF-α等基因表達的研究，來分析探討普洱茶對腸道脂肪吸收與粘膜屏障干預(yù)的可能機制，旨在為今后將普洱茶應(yīng)用于非酒精性脂肪性肝病的防治提供科學(xué)依據(jù)和重要參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

普洱茶（熟茶，散茶，云南德宏志誠茶葉有限公司提供），膽固醇（杭州昊天生物技術(shù)有限公司），Trizol試劑、Realtime PCR引物［英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司］，ReverTra Ace?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green? Realtime PCR試劑［東洋紡（上海）生物科技有限公司］，分光 光度 計 （Nano Drop 1000， Thermo Scientific），RT-PCR儀（Applied Biosystems StepOnePlusTM Real-Time PCR System）。

1.2 實驗方法

1.2.1 普洱茶茶水提取物的制備

按照 1︰15的茶水比例，將普洱茶在100℃沸水中浸提4次，每次持續(xù)10 min；將4次的提取液合并后，用脫脂棉過濾，最后將濾液經(jīng)冷凍干燥，得到普洱茶水提物粉末，并將其置于4℃冰箱保存待用。

1.2.2 動物模型

SD大鼠，清潔級，4～5周齡，雄性，體質(zhì)量（135±8） g，36只，上海斯萊克實驗動物有限公司［SCXK（滬）2007-0005］提供。動物飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心［SYXK（浙）2008-0115］，室溫（23±2）℃，相對濕度60%～70%。

SD大鼠在實驗環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng) 1周后，隨機分為3組：正常對照組、脂肪肝模型組、普洱茶干預(yù)組（分別簡稱對照組、模型組、普洱茶組），每組各12只。對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組和普洱茶組給予高脂飼料（84%普通飼料+14%豬油+2%膽固醇）喂養(yǎng)。從第5周起，普洱茶組每日分別給予普洱茶水提物 1.0 g·kg-1·d-1（根據(jù)體質(zhì)量 60 kg成人每日普洱茶飲用量 10 g為標準以及提取過程中的水浸出物百分含量換算所得，計算公式：大鼠 的 劑 量 =10 g× 0.018/（0.2 kg）≈ 1.0 g·kg-1·d-1），經(jīng)口灌胃，用蒸餾水稀釋，另外兩組每日給予等體積生理鹽水經(jīng)口灌胃。實驗期間大鼠自由飲水和進食。

1.2.3 標本采集

第 8周末處死全部大鼠。處死前禁食 12 h，采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，斷頭處死。腹主動脈插管取血3 mL后取出肝臟稱肝濕重并計算肝指數(shù)（肝指數(shù)=肝濕重/末次體質(zhì)量×100%），取部分肝臟固定于4%中性福爾馬林液中。迅速剪取上段小腸，使用預(yù)冷的 0.9%鹽溶液清洗小腸標本內(nèi)外，放于凍存管后存于-80℃冰箱。

1.2.4 大鼠血脂指標測定

采用全自動生化分析儀由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院檢驗科生化室協(xié)助測定血清TG，TC，HDL-C，LDL-C。

1.2.5 肝組織油紅O染色

肝組織冰凍切片10 μm，油紅O染色10 min，蘇木素復(fù)染1 min，顯微鏡觀察。

1.2.6 小腸組織RT-PCR。

取100 mg小腸標本，按Trizol法提取組織總 RNA。提取得到的 RNA樣本按照ReverTra Ace?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作制備complementary DNA（cDNA）用于RT-PCR，選用大鼠 GAPDH基因作為內(nèi)參。本次實驗PCR所用引物通過查閱相關(guān)文獻及使用Primer Premier 5.0獲得（表1）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

表1 本實驗中使用的RT-PCR引物Table 1 RT-PCR primers used in this experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)及血清血脂水平變化

普洱茶對大鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)及血清血脂水平的影響如表2和表3所示。模型組大鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)及血清LDL-C水平均明顯高于對照組（P＜0.01），血清TG、TC及HDL-C水平無明顯差異。與模型組相比，普洱茶組大鼠體質(zhì)量和血清 LDL-C水平均顯著降低（P＜0.01）分別下降16.12%和42.59%，而肝指數(shù)及血清TG、TC及HDL-C水平無明顯差異（P＞0.05），說明普洱茶能減輕大鼠體質(zhì)量，改善血清 LDL-C水平，具有明顯的減肥、降脂作用。

表2 普洱茶對大鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)的影響Table 2 Effect of Pu-erh tea on body weight and liver index in NAFLD rats

表3普洱茶對大鼠血清血脂水平的影響Table 3 Effect of Pu-erh tea on serum TG， TC， HDL-C， LDL-C level in NAFLD rats

2.2 大鼠肝臟病理學(xué)的變化

采用油紅 O染色各組大鼠肝組織脂肪沉積的情況如圖1所示。從圖1可以觀察到，與正常飼料組比較，模型組大鼠肝細胞內(nèi)脂滴呈彌漫性、顆粒狀堆積，脂滴明顯增大；普洱茶組大鼠肝細胞脂滴數(shù)量明顯減少，散在稀疏，脂滴體積較小，脂肪病變明顯改善；表明普洱茶對高脂引起的大鼠肝臟病理學(xué)的變化有明顯的抑制作用。

2.3 大鼠小腸粘膜CD36 mRNA表達水平的變化

CD36主要存在于十二指腸和空腸，與小腸 LCFA吸收密切相關(guān)，其表達上調(diào)有利于LCFA轉(zhuǎn)運入小腸細胞。由圖2可知，模型組大鼠小腸組織 CD36 mRNA表達水平顯著高于對照組（P＜0.01），提示進食高脂飲食能夠促進小腸吸收細胞膜蛋白 CD36表達代償性上調(diào)，從而導(dǎo)致腸道中LCFA大量進入小腸細胞內(nèi)，并最終轉(zhuǎn)運入肝臟。與模型組相比，普洱茶的 CD36 mRNA表達水平顯著降低（P＜0.01）（圖2），提示普洱茶能夠一定程度下調(diào)小腸CD36的表達，減少從小腸上皮細胞膜外側(cè)轉(zhuǎn)運入細胞膜內(nèi)側(cè)的LCFA，從而減少脂肪酸輸入肝臟，一定程度上起到降血脂和預(yù)防肝臟脂質(zhì)沉積的作用。

2.4 大鼠腸粘膜緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、

ZO-1 mRNA表達水平的改變

緊密連接是腸上皮細胞間的主要連接方式，位于相鄰小腸上皮細胞膜之間，在正常情況下阻隔內(nèi)毒素等大分子物質(zhì)進入血液循環(huán)，其功能的實現(xiàn)受TJPs（Occludin、ZO-1）表達的調(diào)控。上皮細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)受損與NAFLD密切相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)NAFLD患者腸粘膜 Occludin、ZO-1表達下調(diào)［4］，小腸粘膜緊密連接結(jié)構(gòu)破壞，粘膜通透性增大。而我們試驗中發(fā)現(xiàn)和對照組相比，模型組大鼠小腸組織Occludin、ZO-1 mRNA表達水平無明顯差異（P＞0.05），原因可能在于我們的模型組大鼠處于NAFLD病情早期階段，實驗結(jié)束時間可能尚未達到NAFLD大鼠小腸緊密連接功能改變的切點。普洱茶組大鼠小腸組織Occludin、ZO-1 mRNA表達水平均顯著高于模型組（P＜0.01）（圖2），推測普洱茶能夠通過上調(diào)Occludin和ZO-1的表達，一定程度上加強大鼠小腸上皮細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)，起到預(yù)防及改善NAFLD的作用。

圖1 油紅O染色各組大鼠肝組織脂肪沉積情況（×200）Fig. 1 Observation of fat deposition in liver tissue by oil red O staining（×200）

圖2 普洱茶對大鼠小腸組織CD36、Occludin、ZO-1、TNF-α基因mRNA表達的影響Fig. 2 Effect of Pu-erh tea on intestinal CD36， Occludin， ZO-1， TNF-αgene expressions in NAFLD rats

2.5 對大鼠小腸組織TNF-α基因mRNA表達的影響

既往研究發(fā)現(xiàn) NAFLD模型小腸細胞TNF-α表達升高，促進誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表達，使腸細胞一氧化氮（Nitric oxide，NO）合成增加［15］，從而下調(diào)小腸粘膜緊密連接蛋白的表達，小腸粘膜通透性增大，細菌內(nèi)毒素大量進入血液循環(huán)［6］，到達肝臟后進一步造成肝臟的氧化損傷形成NAFLD“二次打擊”。模型組大鼠小腸組織TNF-α mRNA表達顯著高于對照組（P＜0.01），和既往的研究結(jié)論類似。普洱茶組大鼠小腸組織TNF-α mRNA表達水平均顯著低于模型組（P＜0.01）（圖2），說明普洱茶能夠抑制大鼠小腸組織TNF-α的表達，下調(diào)iNOS的表達，從而減少NO的產(chǎn)生，保護小腸上皮細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)，一定程度上改善腸上皮細胞通透率，阻止過多的 LPS通過門靜脈進入肝臟，并最終減少由過多 LPS導(dǎo)致的肝臟炎癥損害。

3 結(jié)論與討論

在NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程中，早期肝臟的脂質(zhì)沉積起到至關(guān)重要的作用［1］。過多游離脂肪酸的沉積對肝臟產(chǎn)生“一次打擊”；蓄積的游離脂肪酸通過反應(yīng)性氧化物對肝臟進行“二次打擊”，促使肝臟單純性脂肪沉積向非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化發(fā)展［1］。食物脂肪攝入，尤其是LCFA攝入增多是體內(nèi)游離脂肪酸攝入的重要環(huán)節(jié)。小腸吸收細胞膜蛋白脂肪酸轉(zhuǎn)位酶 CD36定位于小腸絨毛細胞刷狀緣膜，與LCFA吸收密切相關(guān)［2］。本實驗中第8周末模型組大鼠小腸組織 CD36 mRNA表達水平較對照組明顯升高，提示進食高脂飲食能夠促進小腸吸收細胞膜蛋白 CD36表達代償性上調(diào)，從而導(dǎo)致腸道中LCFA大量進入小腸細胞內(nèi)，并最終轉(zhuǎn)運入肝臟。我們的研究發(fā)現(xiàn)，和模型組相比，普洱茶組大鼠小腸組織CD36 mRNA表達量顯著降低，提示普洱茶能夠下調(diào)小腸CD36的表達，減少小腸細胞LCFA的轉(zhuǎn)運，從而減少肝臟脂肪酸的輸入，從而起到降低血脂和改善肝臟脂質(zhì)沉積的作用。

緊密連接結(jié)構(gòu)屬不通透連接，是小腸上皮細胞間的主要連接方式。正常情況下只允許水分子和離子從銜接處的小孔通過［16］，為最重要的腸粘膜屏障。目前已知的緊密連接相關(guān)蛋白主要有 Occludin［17］、ZO-1［18］等，其表達量調(diào)控著緊密連接的功能和腸上皮粘膜通透率。已有研究發(fā)現(xiàn) NAFLD模型小腸細胞 TNF-α表達升高，促進iNOS的表達，使腸細胞一氧化氮合成增加［15］，增多的TNF-α及NO能夠下調(diào)小腸粘膜緊密連接蛋白的表達，造成粘膜緊密連接結(jié)構(gòu)破壞，小腸粘膜通透性增大，腸道革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素大量進入血液循環(huán)［6］，到達肝臟后進一步促進肝細胞TNF-α產(chǎn)生，誘導(dǎo)肝臟的氧化損傷形成NAFLD“二次打擊”，最終導(dǎo)致肝臟炎癥、壞死和纖維化。由此可見，小腸細胞 TNF-α水平及粘膜緊密連接結(jié)構(gòu)受損與NAFLD密切相關(guān)。本研究再次證實了模型組小腸組織TNF-α mRNA水平高于正常對照組。而普洱茶組 TNF-α水平較脂肪肝模型組均明顯下調(diào)，說明普洱茶能夠抑制大鼠小腸組織 TNF-α的表達，進一步下調(diào)iNOS，從而減少NO的生成。既往文獻發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者 Occludin和 ZO-1表達下調(diào)［4］，而我們的研究發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，模型組大鼠小腸組織Occludin、ZO-1 mRNA表達水平無明顯差異，究其原因可能有以下幾點，一為我們的研究對象為 NAFLD早期階段造模大鼠，實驗結(jié)束時間可能尚未達到NAFLD大鼠小腸緊密連接功能改變的切點；第二可能存在其他緊密連接蛋白的影響，或者緊密連接蛋白在 NAFLD早期階段可能并不是數(shù)量上的改變，而是形態(tài)結(jié)構(gòu)上的變化導(dǎo)致腸道通透性變化，需要進一步的探討。普洱茶組大鼠小腸粘膜 Occludin、ZO-1表達水平明顯升高，推測普洱茶能夠上調(diào)Occludin和ZO-1的表達，加強大鼠小腸上皮細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)，起到預(yù)防及改善NAFLD的作用。這些研究結(jié)果證實了普洱茶對非酒精性脂肪肝大鼠腸道脂肪吸收及粘膜屏障的干預(yù)作用，其機理有待于進一步的研究。

普洱茶屬于后發(fā)酵茶。微生物參與的后發(fā)酵加工過程奠定了普洱茶保健功效的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，其原料曬青毛茶中的化學(xué)成分在高溫高濕的環(huán)境中發(fā)生了復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化，形成了一系列決定普洱茶風(fēng)味品質(zhì)的關(guān)鍵品質(zhì)化學(xué)成分以及生物活性成分，例如茶褐素［19］、普洱素（8-C取代的黃烷-3-醇成分）［20］、他汀類成分［21］、沒食子酸［22］、黃酮類成分［23-25］等。本文報道了普洱茶對調(diào)控NAFLD大鼠小腸組織相關(guān)基因表達的作用，但具體是由普洱茶中的哪種生物化學(xué)成分產(chǎn)生的，是否存在協(xié)同作用，這一系列的問題都具有重要的研究價值和研究意義。

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中圖分類號：TS272.5+4；R972+.6

文獻標識碼：A

文章編號：1000-369X（2016）03-237-08

收稿日期：2015-12-21

修訂日期：2016-01-25

基金項目：中醫(yī)藥重點研究計劃（2012ZZ011）

作者簡介：朱晟易，男，碩士研究生，主要從事非酒精性脂肪性肝病早期預(yù)防和治療的研究。*通訊作者：songzy@medmail.com.cn

Effect of Pu-erh Tea on Long Chain Fatty Acid Metabolism and Expression of Tight Junction Proteins in the Rat Model of Non-alcoholic Fatty Liver Disease

ZHU Shengyi1， TONG Yuling1， ZHAO Yi1， Lü Haipeng2， LIN Zhi2，SHEN Guoli1， SUN Ting1， SONG Zhenya1*
1. The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University， School of Medicine， Hangzhou 310009， China；2. Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization of Ministry of Agriculture， Tea Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310008， China

Abstract:In this study， the influence of Pu-erh tea on the absorption of long chain fatty acids in non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD） rats was analyzed. Moreover， the possible interventional mechanism was also discussed. Thirty-six SD rats were randomly divided into three groups， normal group （NG）， NAFLD group， and Pu-erh tea group （PTG）， 12 rats for each group. All rats were killed after 8 weeks. Rat weight， liver index， serum lipid level，intestinal lipid absorption protein （CD36）， tight junction proteins （Occludin， ZO-1）， and TNF-α mRNA were measured.Compared with NAFLD group， rat weight and serum LDL-C in PTG were decreased by 16.12% and 42.59%， respectively. In addition， the expressions of CD36 and TNF-α mRNA in PTG were decreased， while occludin and ZO-1 mRNA expressions were increased. Our results suggest that Pu-erh tea can regulate the intestinal absorption of long chain fatty acids and the tight junction proteins in rats， and it is especially effective in prophylaxis against ‘the first attack’in the early stage of NAFLD.

Keywords:Pu-erh tea， nonalcoholic fatty liver disease （NAFLD）， lipid metabolism， tight junction