李建宇，史夢(mèng)竹，傅建煒*，王婷，張志康

茶假眼小綠葉蟬抗聯(lián)苯菊酯品系和敏感品系解毒酶活性及增效作用研究

李建宇1，史夢(mèng)竹1，傅建煒1*，王婷1，張志康2

1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，福建 福州 350013；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128

摘要：為了明確茶假眼小綠葉蟬（Empoasca vitis）對(duì)聯(lián)苯菊酯代謝抗性相關(guān)的解毒酶，本研究采用室內(nèi)生物測(cè)定和生化分析方法，比較了假眼小綠葉蟬抗聯(lián)苯菊酯品系和敏感品系的 3種解毒酶活性差異，并分析了 3種增效劑對(duì)聯(lián)苯菊酯的增效作用。解毒酶活性測(cè)定表明，茶假眼小綠葉蟬抗聯(lián)苯菊酯品系羧酸酯酶（CarE）、細(xì)胞色素P450氧化酶O-脫甲基（PNOD）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）比活力都高于敏感品系，3種解毒酶活性分別為敏感品系的 2.09倍、4.34倍和 1.59倍。增效劑磷酸三苯酯（TPP）、增效醚（PBO）和順丁烯二酸二乙酯（DEM）在茶假眼小綠葉蟬敏感品系中的增效比分別為1.04、1.09、1.00，而在聯(lián)苯菊酯抗性品系中的增效比分別為 1.80、7.97、1.03。上述結(jié)果證明，羧酸酯酶和細(xì)胞色素 P450氧化酶活性的增強(qiáng)在茶假眼小綠葉蟬對(duì)聯(lián)苯菊酯的抗性產(chǎn)生中起到了重要的作用。

關(guān)鍵詞：茶假眼小綠葉蟬；聯(lián)苯菊酯；抗性；解毒酶；增效作用

假眼小綠葉蟬（Empoasca vitis G?the）以成蟲和若蟲吸取茶樹芽葉汁液，導(dǎo)致茶芽葉生長(zhǎng)遲緩，焦邊、焦葉，嚴(yán)重影響茶葉的品質(zhì)和產(chǎn)量［1-2］。由于假眼小綠葉蟬個(gè)體小、易隱蔽，且世代重疊嚴(yán)重，防治困難，目前仍以化學(xué)農(nóng)藥作為主要防治手段。其中，聯(lián)苯菊酯是防治小綠葉蟬的主要藥劑，它屬擬除蟲菊酯類仿生合成殺蟲劑，具有觸殺、胃毒等作用［3］，對(duì)茶假眼小綠葉蟬成蟲及若蟲都具有較好的防治效果。但是，由于長(zhǎng)期過度使用聯(lián)苯菊酯防治，致使假眼小綠葉蟬對(duì)聯(lián)苯菊酯產(chǎn)生了不同程度的抗性［4-5］。然而研究假眼小綠葉蟬對(duì)聯(lián)苯菊酯的抗性機(jī)理的報(bào)道幾乎沒有。

在靶標(biāo)抗性、穿透抗性及代謝抗性等多種昆蟲的抗藥性機(jī)制中，昆蟲解毒酶代謝能力增強(qiáng)所導(dǎo)致的代謝抗性是昆蟲對(duì)殺蟲藥劑產(chǎn)生抗性的重要機(jī)制之一［6］，昆蟲體內(nèi)的解毒酶主要有多功能氧化酶、羧酸酯酶以及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶等，與昆蟲對(duì)有機(jī)氯類、有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類等多種殺蟲劑的抗性普遍相關(guān)［7-9］。增效劑是一類無生物活性的化合物，能夠抑制或削弱抗性昆蟲體內(nèi)解毒酶系對(duì)農(nóng)藥的解毒作用，提高藥劑的生物活性，延緩抗藥性，在抗藥機(jī)理研究和抗性治理中有很重要的作用［10］。在殺蟲藥劑中添加適量的增效劑，可抑制害蟲代謝酶活性，顯著提高殺蟲效果，對(duì)于減少殺蟲劑的用量、降低殺蟲劑的抗性風(fēng)險(xiǎn)以及害蟲的抗藥性治理均有重要意義。

鑒于聯(lián)苯菊酯在茶假眼小綠葉蟬防治中的重要作用，本研究檢測(cè)了茶假眼小綠葉蟬聯(lián)苯菊酯抗性品系的酯酶、谷脫甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶和多功能氧化酶的活性，并測(cè)定了增效醚（PBO）、順丁烯二酸二乙酯（DEM）和磷酸三苯酯（TPP）3種增效劑在茶假眼小綠葉蟬抗性品系中對(duì)聯(lián)苯菊酯的增效作用，初步研究了茶假眼小綠葉蟬對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑聯(lián)苯菊酯產(chǎn)生抗性的生化機(jī)理，以期為制定假眼小綠葉蟬田間抗性的延緩和治理方案，以及延長(zhǎng)聯(lián)苯菊酯制劑的使用壽命提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及寄主

敏感品系：假眼小綠葉蟬于2012年9月采自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所南通中試基地茶圃，未接觸任何殺蟲劑，繼代飼養(yǎng)于該基地人工氣候室30代以上，于2015年5月測(cè)定其對(duì)聯(lián)苯菊酯的LC50為0.7084 mg·L-1。

抗性品系：2013年5年月釆自福建省建甌市東峰茶園（LC50為33.4274 mg·L-1），在室內(nèi)用聯(lián)苯菊酯篩選了 25代，于 2015年 5月測(cè)定其對(duì)聯(lián)苯菊酯的LC50為67.6722 mg·L-1（表1），抗性倍數(shù)達(dá)95.53倍。

室內(nèi)飼養(yǎng)條件為：溫度（26±1）℃，光照周期為 14 h光照、10 h黑暗，相對(duì)濕度70%～80%。飼養(yǎng)用茶枝采自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所南通中試基地茶圃，該茶圃從未施用任何化學(xué)農(nóng)藥和肥料，僅人工除草、澆水。

1.2 試驗(yàn)儀器及藥劑

TU-1900型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）、數(shù)顯三用恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司）、AG 5805型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）、超低溫冰箱（海爾集團(tuán)）、MD/VersaMax酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）。

2.5%聯(lián)苯菊酯乳油（美國(guó)富美實(shí)公司）；90%增效醚 PBO、97%順丁烯二酸二乙酯DEM、99%磷酸三苯酯TPP（均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司）；乙二胺四乙酸 EDTA （Biosharp生物科技公司）；二巰基蘇糖醇DTT（北京索萊寶（Solarbio）科技有限公司）；苯基硫脲、對(duì)硝基苯甲醚、還原型輔酶ⅡNADPH（均購(gòu)自 Aladdin-阿拉丁試劑（上海）有限公司）。

1.3 毒力測(cè)定

聯(lián)苯菊酯對(duì)茶假眼小綠葉蟬的毒力測(cè)定參照NY/T 1154.14—2008方法（浸葉法）［11］并作部分改動(dòng)：將未被藥劑污染的新鮮茶枝剪成一腋一葉；茶枝浸藥 15 s后取出并自然晾干；將晾干的茶枝插入保濕的花泥中，并置于50 mL（直徑2.5 cm）的離心管中；之后將茶小綠葉蟬成蟲轉(zhuǎn)移至離心管中的茶葉片上，每管接入10頭茶小綠葉蟬成蟲，蓋上通風(fēng)的蓋子，防止試蟲逃逸。每處理5次重復(fù)，以清水處理為對(duì)照。48 h后檢查死亡蟲數(shù)，計(jì)算死亡率。死亡標(biāo)準(zhǔn)為輕觸蟲體后觀察無任何動(dòng)靜或其他反應(yīng)則視為死亡。

1.4 增效劑試驗(yàn)

3種增效劑PBO、TPP、DEM均采用丙酮溶解，選擇對(duì)抗性和敏感品系茶假眼小綠葉蟬無致死作用的最高質(zhì)量濃度 100 mg·L-1作為增效劑添加的最終濃度，配制不同濃度的聯(lián)苯菊酯藥液，按1.3中毒力測(cè)定的方法進(jìn)行增效劑增效作用測(cè)定。

增效值用 Bradford［12］的方法計(jì)算，增效比（SR）=單一藥劑對(duì)假眼小綠葉蟬的LC50值/藥劑加增效劑處理的假眼小綠葉蟬的LC50值。

1.5 酶活性測(cè)定方法

1.5.1 細(xì)胞色素P450氧化酶活力測(cè)定

細(xì)胞色素 P450氧化酶（以對(duì)硝基苯甲醚為底物，PNOD）活力測(cè)定參考Rose等［13］的方法。每個(gè)品系取小綠葉蟬試蟲 200頭，冰浴勻漿，勻漿液為0.1 mol·L-1、pH 7.8磷酸緩沖液（含1 mmol·L-1EDTA、1 mmol·L-1DTT、1 mmol·L-1苯基硫脲、20%甘油）。10 000 g·min-1、4℃下離心40 min，取上清液在4℃下保存?zhèn)溆谩Ｔ?6孔酶標(biāo)板中依次加入100 μL 2 μmol·L-1對(duì)硝基苯甲醚、10 μL 9.6 mmol·L-1的NADPH和90 μL酶液，酶促反應(yīng)在 30℃下進(jìn)行。用酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)下記錄光密度值，每隔25 s記錄1次，共記錄26次，數(shù)據(jù)記錄與處理采用SOFTmaxPRO軟件，取光密度值范圍在0～0.2之間的數(shù)據(jù)計(jì)算反應(yīng)速度，以反應(yīng)速度表示酶活力（每毫克組織蛋白每分鐘吸光值變化0.001作為一個(gè)酶活力單位U）。

1.5.2 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活力測(cè)定

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活力采用南京建成生物工程研究所的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定方法參照試劑盒說明書。本試劑盒包括基質(zhì)液、20 μmol·L-1GSH標(biāo)準(zhǔn)品以及試劑二、三、四。準(zhǔn)確稱取待測(cè)樣本0.2 g，按照m（g）∶V（mL）=1∶9的比例加入生理鹽水，冰水浴條件機(jī)械勻漿，2 500 g·min-1，離心10 min，取上清液待測(cè)。不同處理谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活力的活性按照測(cè)定試劑盒說明書在測(cè)定管和對(duì)照管中分別加基質(zhì)液、樣本和試劑二后進(jìn)行酶促反應(yīng)，4 000 g·min-1，離心 10 min，取上清2 mL作顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)中空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管和對(duì)照管分別按說明書加入試劑二、標(biāo)準(zhǔn)品、試劑三和試劑四后混勻，室溫靜置15 min后，用分光光度計(jì)于412 nm波長(zhǎng)處比色。將每毫克組織蛋白在37℃反應(yīng)1 min，扣除非酶促反應(yīng)，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol·L-1為1個(gè)酶活力單位U。

1.5.3 酯酶活力測(cè)定

羧酸酯酶活力采用南京建成生物工程研究所的羧酸酯酶活性測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定方法參照試劑盒說明書。本試劑盒中試劑一為提取液；試劑二為工作液。按照組織質(zhì)量（g）與提取液體積（mL）為1∶5～10的比例，加入1 mL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿。15 000 g·min-1，4℃離心 30 min，取上清液待測(cè)。在 1 mL比色皿中加入 5 μL蒸餾水作為空白管，測(cè)定管則依次加入 5 μL上清液，然后上述管中分別加入 1 000 μL預(yù)熱的試劑二，迅速混勻后用分光光度計(jì)于450 nm測(cè)定10 s和190 s光吸收值，計(jì)算酯酶活性。將每毫克組織蛋白在37℃反應(yīng)，每分鐘催化吸光值增加1，定義為1個(gè)酶活力單位U。

2 結(jié)果與分析

2.1 TPP、PBO和DEM對(duì)聯(lián)苯菊酯的增效作用

表 1顯示，聯(lián)苯菊酯對(duì)茶假眼小綠葉蟬敏感品系和抗性品系的LC50分別為0.7084 mg·L-1和67.6722 mg·L-1。TPP、PBO和DEM在茶小綠葉蟬敏感品系中對(duì)聯(lián)苯菊酯毒力的增效比分別為1.04、1.09、1.00，而在聯(lián)苯菊酯抗性品系中的增效比分別為1.80、7.97、1.03（圖1）?？梢姡琓PP和PBO在茶小綠葉蟬聯(lián)苯菊酯抗性品系中對(duì)聯(lián)苯菊酯的毒力均有明顯的增效作用，而DEM的增效作用不明顯。

2.2 聯(lián)苯菊酯抗性品系和敏感品系茶假眼小綠葉蟬的解毒酶活力差異

2.2.1 細(xì)胞色素P450氧化酶活性

對(duì)茶假眼小綠葉蟬聯(lián)苯菊酯品系和抗性品系的細(xì)胞色素P450氧化酶活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖2?？剐云废岛兔舾衅废档募?xì)胞色素P450氧化酶比活力分別為1.22 U·mg-1和0.28 U·mg-1，差異達(dá)顯著水平（F=2281.94， P＜0.0001）；抗性品系的細(xì)胞色素P450氧化酶活性是敏感品系的 4.34倍，表明假眼小綠葉蟬對(duì)聯(lián)苯菊酯的抗性形成可能與其細(xì)胞色素P450氧化酶活性的增加有關(guān)（圖2）。

表1 TPP、PBO、DEM在假眼小綠葉蟬抗性和敏感品系中對(duì)聯(lián)苯菊酯的增效作用Table 1 Synergistic effect of TPP， PBO and DEM in bifenthrin-resistant and susceptible strains of E. vitis

圖1 TPP、PBO和DEM 3種增效劑對(duì)聯(lián)苯菊酯的增效作用Fig. 1 Synergistic effect of TPP， PBO and DEM on bifenthrin

2.2.2 羧酸酯酶活性

由圖3可以看出，假眼小綠葉蟬抗聯(lián)苯菊酯品系和敏感品系的羧酸酯酶活力差異顯著（F=15.35， P=0.0173），抗性品系的羧酸酯酶活性是敏感品系的 2.09倍。說明假眼小綠葉蟬對(duì)聯(lián)苯菊酯的抗性形成與羧酸酯酶活性的增強(qiáng)也有一定的關(guān)系。

2.2.3 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性

假眼小綠葉蟬抗聯(lián)苯菊酯品系和敏感品系的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活力分別為 82.55 U·mg-1和51.81 U·mg-1（圖4），抗性品系的

圖2 假眼小綠葉蟬抗性和敏感品系細(xì)胞色素P450氧化酶活力比較Fig. 2 Comparison of Cytochrome P450 oxidase activities in E. vitis

圖3 假眼小綠葉蟬抗性和敏感品系羧酸酯酶活力比較

圖4 假眼小綠葉蟬抗性和敏感品系谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活力比較Fig. 4 Comparison of glutathione S-transferase activities in E. vitis

Fig. 3 Comparison of carboxylesterase activities in E. vitis谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性是敏感品系的 1.59倍（F=66.92， P＜0.0001），表明假眼小綠葉蟬對(duì)聯(lián)苯菊酯的抗性形成與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶有一定關(guān)系，但是不同品系的活性差異不如細(xì)胞色素P450氧化酶活性和羧酸酯酶活性的差異大。

3 小結(jié)與討論

本研究表明增效劑TPP、PBO和DEM在假眼小綠葉蟬敏感品系中增效作用不明顯，而在聯(lián)苯菊酯抗性品系中 TPP、PBO的增效作用較明顯，DEM則增效不明顯。由于TPP、PBO和DEM分別是羧酸酯酶、細(xì)胞色素P450氧化酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的抑制劑，因此，細(xì)胞色素P450氧化酶和羧酸酯酶的活性變化是假眼小綠葉蟬對(duì)聯(lián)苯菊酯產(chǎn)生抗性的原因之一。

細(xì)胞色素 P450氧化酶通過酶活性的升高從而降低殺蟲劑的殺蟲效果，表現(xiàn)為昆蟲對(duì)有機(jī)磷類、擬除蟲菊酯類和新煙堿類殺蟲劑產(chǎn)生抗性。這種抗性機(jī)制在關(guān)于小菜蛾 Plutella xyllostella［14］、煙粉虱Bemisia tabaci［15］、桃蚜Myzus persicae［16］的研究中均有報(bào)道。在殺蟲劑的選擇壓力下，昆蟲羧酸酯酶產(chǎn)生了相應(yīng)的反應(yīng)，導(dǎo)致抗性昆蟲中羧酸酯酶活性有所增高。羧酸酯酶活性增高引起了褐飛虱 Nilaparvata lugens［17］、棉蚜Aphis gossypii［18-19］對(duì)有機(jī)磷殺蟲劑抗性的產(chǎn)生。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶是昆蟲對(duì)外源有毒物質(zhì)代謝途徑中重要的酶系之一。Rumpf等［20］用氯氰菊酯亞致死劑量處理褐蛉幼蟲后，發(fā)現(xiàn)其GST活性明顯增加；小菜蛾對(duì)有機(jī)磷類殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的重要機(jī)制之一就是抗性品系小菜蛾體內(nèi)GSTs的高活力［21］。本研究結(jié)果表明，茶假眼小綠葉蟬聯(lián)苯菊酯抗性品系和敏感品系的細(xì)胞色素 P450氧化酶和羧酸酯酶活性差異顯著，且PBO和TPP增效作用明顯，說明這兩種酶活性的變化與茶假眼小綠葉蟬對(duì)聯(lián)苯菊酯的抗性有關(guān)。同時(shí)，抗性品系中茶假眼小綠葉蟬的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活力也有所增加，但DEM的增效作用不明顯，因此，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶與茶假眼小綠葉蟬抗性是否相關(guān)有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究中對(duì)假眼小綠葉蟬解毒酶活性的測(cè)定是在短期藥劑脅迫下進(jìn)行的，因此要明確解毒酶是否參與了假眼小綠葉蟬對(duì)聯(lián)苯菊酯的抗性，還需進(jìn)一步深入系統(tǒng)地研究。

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中圖分類號(hào)：S571.1；S435.711

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-369X（2016）03-323-07

收稿日期：2015-11-04

修訂日期：2016-01-19

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金（2013J01112）

作者簡(jiǎn)介：李建宇，男，助理研究員，主要從事農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治、農(nóng)藥毒理與生物安全研究。*通訊作者：fjw9238@163.com

Activities of the Detoxifying Enzymes and Synergism in the Bifenthrin-resistant and Susceptible Strains of Tea Leafhopper， Empoasca vitis

LI Jianyu1， SHI Mengzhu1， FU Jianwei1*， WANG Ting1， ZHANG Zhikang2
1. Institute of Plant Protection， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou 350013， China；2. College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China

Abstract:Tea green leafhopper， Empoasca vitis， is the most serious pest in tea gardens. The detoxifying enzyme activities and synergism in the bifenthrin-resistant and susceptible leafhopper were measured via biochemical methods and bioassays to clarify their potential relationship to the resistance of tea leafhopper to bifenthrin. The detoxifying enzyme activity tests showed that the activities of carboxylesterase （CarE）， Cytochrome P450-mediated O-demethylation activity toward p-nitroanisole （PNOD） and glutathione-S-transferase （GST） in the resistant strain were all higher than those in susceptible strain. The activities of the three detoxifying enzymes in bifenthrin-resistant strain were 2.09， 4.34 and 1.59 folds those of the susceptible strain respectively. Synergism tests showed that the synergist ratios of triphenyl phosphate （TPP）， piperonyl buoxide （PBO） and diethyl maleate （DEM） were 1.04， 1.09，and 1.00 folds respectively in the bifenthrin-susceptible strain and 1.80， 7.97 and 1.03 foldsrespectively in the bifenthrin-resistant strain. These results indicate that CarE and PNOD play important roles in bifenthrin resistance oftea leafhoppers.

Keywords：Empoasca vitis， bifenthrin， resistance， detoxifying enzymes， synergism