王曉玉，紀(jì)　鋒，徐黎明，趙景壯，劉　淼，曹永生，尹家勝

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱　150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上?！?01306)

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哲羅鮭胰島素樣生長因子-I(IGF-I)cDNA分子克隆、序列分析及組織表達(dá)

王曉玉1,2，紀(jì)鋒1,2，徐黎明1，趙景壯1，劉淼1，曹永生1，尹家勝1

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306)

摘要：采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法，從哲羅鮭(Hucho taimen)肝臟的總RNA中擴(kuò)增出胰島素樣生長因子-I(IGF-I)的cDNA開放閱讀框(Open reading frame,ORF)序列，運(yùn)用軟件對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用熒光實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測了哲羅鮭成魚不同組織中IGF-I mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，IGF-I 基因的cDNA開放閱讀框?yàn)?73 bp，編碼190個氨基酸，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為9.21，氨基酸結(jié)構(gòu)由信號肽、B、C、A、D結(jié)構(gòu)域及E肽組成；氨基酸序列與其他鮭科魚類具有較高的同源性，其中與北極紅點(diǎn)鮭的IGF-I同源性最高(99.2%)；組織表達(dá)分析顯示，哲羅鮭IGF-I mRNA在肝臟中表達(dá)量最高，在鰓、前腸中次之，在腦、頭腎、脾、心、胃和肌肉等組織中的表達(dá)量較低。

關(guān)鍵詞：哲羅鮭(Hucho taimen)；胰島素樣生長因子-I(IGF-I)；進(jìn)化樹；組織表達(dá)

哲羅鮭(Huchotaimen)又稱哲羅魚，屬鮭形目(Samoniformes)鮭科(Salmonidae)哲羅魚屬(Hucho)，是名貴的大型冷水性魚類，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值。近年來，由于哲羅鮭生態(tài)環(huán)境遭到破壞，資源下降，導(dǎo)致種群數(shù)量減少[1]。國內(nèi)外對于哲羅鮭的研究主要集中在區(qū)域變化、遺傳育種、種群結(jié)構(gòu)等方面，但對于分子生理學(xué)，尤其是胰島素樣生長因子(IGF)系統(tǒng)的研究較少。

魚類胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factors,IGF)是一類具有胰島素樣代謝和促進(jìn)有絲分裂功能的多肽，包括IGF-I和IGF-II，但近年來Wang等研究羅非魚發(fā)現(xiàn)新成員IGF-III[2]。IGF-I具有調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，促進(jìn)細(xì)胞生長、分化和分裂，抑制細(xì)胞死亡和調(diào)節(jié)滲透壓等多種生理功能[3-4]。對哲羅鮭的IGF-I基因進(jìn)行深入研究，在哲羅鮭的育種及養(yǎng)殖管理等方面都具有重要的指導(dǎo)作用。魚類IGF-I主要在肝臟中合成，并由GH調(diào)節(jié)，但I(xiàn)GF-I不僅在肝臟中表達(dá)，在腦、腸、鰓、腎等組織中也有表達(dá)，而且大都是通過自分泌和旁分泌方式釋放[5]，其主要在胚后發(fā)育和成年期發(fā)揮促生長作用[6]。目前，魚類中已經(jīng)有牙鲆[7]、尼羅羅非魚[8]、斑馬魚[9]和馬蘇大馬哈魚[10]等硬骨魚類獲得了IGF-I cDNA部分及全長基因序列，揭示了IGF-I在進(jìn)化過程中的保守性。

本研究克隆獲得了哲羅鮭IGF-I基因的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)序列，對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對哲羅鮭心臟、肝臟、頭腎、脾、胃、前腸、后腸、鰓、腦和肌肉等十種組織的IGF-I mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步了解IGF-I基因的功能和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)用哲羅鮭采自中國水產(chǎn)科學(xué)院黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水魚試驗(yàn)站，為2齡魚，體重約0.75 kg。

一步法RT-PCR試劑盒、PCR試劑、Taq聚合酶、DNA Marker、pMD18-T simple Vector、限制性內(nèi)切酶及SYBR?premix Ex TaqTMII(Tli RnaseH Plus)均購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒及SV Total RNA Isolation kit購自Promega公司；First Strand cDNA Synthesis Kit (ReverTra Ace-α-)試劑盒購自TOYOBO公司。

1.2引物設(shè)計與合成

對Genbank收錄的多條鮭鱒魚IGF-I基因開放閱讀框序列進(jìn)行比對，然后選擇北極紅點(diǎn)鮭的IGF-I基因開放閱讀框序列(NCBI登錄號為：GU933431.1)為模板，利用Primer5.0設(shè)計用于擴(kuò)增哲羅鮭ORF序列的引物P-F、P-R，分別在上、下游引物的5′端添加了BsaI 和BamH I酶切位點(diǎn)(酶切位點(diǎn)見下劃線標(biāo)識)。

根據(jù)擴(kuò)增出的哲羅鮭的IGF-I基因開放閱讀框，設(shè)計用于熒光定量PCR的引物IGF-I-F、IGF-I-R。引物均由博仕生物技術(shù)有限公司合成(見表1)。用于熒光定量PCR的內(nèi)參引物β-actin-F、β-actin-R和18s-F、18s-R，是由豐程程[11]根據(jù)擴(kuò)增出的哲羅鮭的β-actin和18s基因的片段而設(shè)計的用于做熒光定量的內(nèi)參引物。

表1　引物序列及退火溫度

注：下劃線部分為引入的酶切位點(diǎn)

1.3IGF-I基因克隆

1.3.1IGF-I基因的獲得

按照Promega公司SV Total RNA Isolation System試劑盒的方法提取2齡哲羅鮭肝臟總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量和濃度。按照TOYOBO公司First Strand cDNA Synthesis Kit (ReverTra Ace-α-) 試劑盒的方法對提取后的RNA進(jìn)行RT-PCR一步反應(yīng)擴(kuò)增IGF-I基因。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.3.2產(chǎn)物純化及測序

用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。純化產(chǎn)物與pMD18-T simple Vector連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)LB平板倒置培養(yǎng)后，挑取單菌落培養(yǎng)并進(jìn)行PCR鑒定。選擇陽性克隆送哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司測序。

1.4IGF-Ⅰ基因的序列分析

在NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫中搜索脊椎動物IGF-I的氨基酸序列，利用Clustal X軟件和MEGA5.0軟件對哲羅鮭及十九種脊椎動物IGF-I氨基酸序列進(jìn)行多重對比，并采用Neighbor-Joining法(1 000 runs,Amino:p-distance)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。用于IGF-I核苷酸序列和氨基酸序列同源性比對分析及進(jìn)化樹構(gòu)建的物種名稱和登錄號列于表2。

表2　本研究所用物種IGF-I的NCBI登錄號

1.5IGF-I組織表達(dá)情況分析

分別取三尾2齡哲羅鮭的心臟、肝臟、頭腎、脾、胃、前腸、后腸、鰓、腦和肌肉組織，于液氮中迅速冷凍，并保存于-80 ℃超低溫冰箱中。運(yùn)用Trizol方法提取各組織RNA，首先將組織在液氮中研磨成粉末，取100 mg組織粉末，加入1 mL Trizol冰上裂解；加0.2 mL氯仿進(jìn)行抽提；取400 μL上清液，用0.5 mL異丙醇沉降RNA，再用1 mL 75%乙醇洗滌去除雜質(zhì)；用DEPC水溶解RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，并用紫外分光光度計測定RNA的A260∶A280值和RNA濃度。按照PremeScriptTMRT reagent Kit操作方法去除組織DNA，將RNA定量至1 μg，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

把各組織cDNA按一倍稀釋，按照SYBR premix Ex TaqTMII (Tli RnaseH Plus) 試劑盒操作方法配制反應(yīng)液，在ABI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。以哲羅鮭的脾作為參照，每個組織設(shè)置3個重復(fù)。擴(kuò)增參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性15 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；循環(huán)數(shù)40個。運(yùn)用2-△△Ct法計算基因表達(dá)量，所有數(shù)據(jù)以平均相對量展現(xiàn)(Means±SD)。

2結(jié)果與分析

2.1哲羅鮭IGF-I基因片段的克隆

哲羅鮭肝臟總RNA經(jīng)過RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，發(fā)現(xiàn)在500～750 bp之間有一明顯條帶，與預(yù)期的目的條帶大小相符(573 bp)(圖1)。將PCR產(chǎn)物純化回收后與pMD18-T simple Vector連接，并利用BsaI/BamH I對重組質(zhì)粒pMD18-T-IGF-I進(jìn)行酶切鑒定(圖2)。將鑒定正確的pMD18-T-IGF-I進(jìn)行測序鑒定，得到開放閱讀框(ORF)長度為573 bp的IGF-I基因片段，在NCBI上BLAST分析后發(fā)現(xiàn)此基因片段與北極紅點(diǎn)鮭的IGF-I基因同源性高達(dá)99%，判斷出此序列是哲羅鮭IGF-I基因。

圖1　IGF-I基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2　IGF-I重組質(zhì)粒酶切鑒定

1.IGF-I重組質(zhì)粒；2.雙酶切后的IGF-I重組質(zhì)粒；M.DL2000分子標(biāo)準(zhǔn)

2.2哲羅鮭IGF-I基因的氨基酸結(jié)構(gòu)分析

本研究獲得的哲羅鮭IGF-I基因的cDNA開放閱讀框?yàn)?73 bp，編碼含190個氨基酸的蛋白質(zhì)(圖3)。利用Protean軟件預(yù)測確定IGF-I蛋白的相對分子質(zhì)量為21.01 kDa，等電點(diǎn)為9.21。對IGF-I的氨基酸結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)，哲羅鮭的IGF-I與其他鮭鱒魚類結(jié)構(gòu)相似，其由信號肽、B、C、A、D結(jié)構(gòu)域和E肽組成。其中信號肽含有46個氨基酸殘基、E肽含有74個氨基酸殘基，而B、C、A、D結(jié)構(gòu)域分別含有29、12、21、8個氨基酸殘基。

2.3哲羅鮭IGF-I基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

對比二十個物種的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，哲羅鮭的IGF-I氨基酸序列與斑鱒、北極紅點(diǎn)鮭、大西洋鮭、虹鱒、鮭魚的同源性為99.4%～96.3%。因此鮭科魚類的IGF-I基因相對保守，而與其他硬骨魚類的同源性在87.7%～82.9%之間。哲羅鮭的IGF-I氨基酸序列與金倉鼠、綠頭鴨、人、中華鱉、野豬及牛等其他6種動物的同源性最低，僅72.5%～66.4%(見圖4所示)。

圖3　哲羅鮭IGF-I ORF的cDNA和氨基酸序列

圖4　哲羅鮭IGF-Ⅰ氨基酸序列與其他物種IGF-I同源性比較

基于以上獲得的氨基酸序列，利用Mega5.05軟件，以鄰位相連法(Neighbor-joining)構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖5)。結(jié)果與同源性的分析相一致，哲羅鮭與斑鱒、北極紅點(diǎn)鮭、大西洋鮭、虹鱒、鮭魚聚類為一枝，說明哲羅鮭IGF-I與鮭鱒魚IGF-I的親緣關(guān)系較近，與其他硬骨魚類的分化較遠(yuǎn)。整個魚類作為一個大枝聚類在一起，與此相對的是其他幾種非魚類脊椎動物聚為一個大枝，說明哲羅鮭IGF-I與哺乳類、鳥類及兩棲類等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。該系統(tǒng)進(jìn)化樹中的各物種親緣關(guān)系與其傳統(tǒng)地位相一致。

圖5　IGF-Ⅰ氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4哲羅鮭IGF-I的組織表達(dá)分析

利用實(shí)時熒光定量PCR分析哲羅鮭IGF-I基因在不同組織中的表達(dá)情況，本研究以18S及β-actin作為內(nèi)參基因?qū)Ω鹘M織起始RNA進(jìn)行校正。對哲羅鮭不同組織IGF-I基因及18S和β-actin進(jìn)行實(shí)時熒光定量實(shí)驗(yàn)，分別進(jìn)行3組重復(fù)，以脾組織作為對照，采用2-△△Ct法分析不同組織中IGF-I mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，哲羅鮭IGF-I mRNA在所有被檢測組織中均有表達(dá)，其中在肝臟中的表達(dá)量最高，鰓中的表達(dá)量次之，在肌肉中的表達(dá)量最低。(圖6)

圖6　哲羅鮭各組織IGF-I mRNA的相對表達(dá)含量

3討論

本研究成功克隆獲得了哲羅鮭IGF-I基因的開放閱讀框，大小為573bp，編碼190個氨基酸。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行生物學(xué)分析，顯示哲羅鮭IGF-I序列與虹鱒IGF-I序列結(jié)構(gòu)相似[12]，包括信號肽、B、C、A、D結(jié)構(gòu)域及E肽三部分，且含有6個半胱氨酸殘基。6個半胱氨酸殘基可形成3對二硫鍵，從而形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)并保持相應(yīng)的功能。但哲羅鮭IGF-I成熟肽的第27位氨基酸殘基與虹鱒不同，且哲羅鮭IGF-I的E肽所含氨基酸殘基比虹鱒多12個，這可能是哲羅鮭與虹鱒產(chǎn)生差異的原因之一。氨基酸序列同源性比對分析發(fā)現(xiàn)哲羅鮭IGF-I與北極紅點(diǎn)鮭IGF-I同源性最高，為99.4%，與其他鮭科魚類的同源性也均在96%以上。而與其他硬骨魚類的同源性較低，在87.7%～82.9%之間，與金倉鼠、綠頭鴨、人、中華鱉、野豬及牛等其他動物的同源性最低，僅72.5%～66.4%。同樣，系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果顯示與同源性分析結(jié)果一致，且進(jìn)化樹的結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)分類學(xué)的結(jié)論相一致。IGF-I在不同魚類間的高度保守性說明其在進(jìn)化過程中始終保留著重要的功能結(jié)構(gòu)，但是根據(jù)自身的身體條件以及生長環(huán)境的影響也發(fā)生了一定的變異。

本研究利用熒光定量PCR檢測了哲羅鮭十種組織中IGF-ImRNA的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，IGF-I在肝臟中的表達(dá)量最高，這與已研究過的花鱸[13]、日本白鯽[14]、波紋短須石首魚[15]和銀大馬哈魚[16]的結(jié)果相似。肝臟是分泌IGF-I的主要部位，但I(xiàn)GF-I的表達(dá)也呈現(xiàn)出多樣性，例如本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示哲羅鮭IGF-I在脾、心、腎、腸以及肌肉等組織中也有少量表達(dá)，甚至有研究者在大麻哈魚的脂肪中也檢測到有IGF-I的表達(dá)[17]。表明魚類IGF-I通過這些組織細(xì)胞的自分泌和旁分泌而作用于自身組織細(xì)胞發(fā)揮生理作用。哲羅鮭IGF-I在肌肉、后腸等組織中的表達(dá)量不是十分明顯，出現(xiàn)此種情況的原因有很多，可能是IGF-I的表達(dá)受多種因素的調(diào)控所致，例如激素水平、營養(yǎng)狀況、生長環(huán)境等因素的調(diào)控；也可能是個體差異所致。

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(責(zé)任編輯：張瀟峮)

收稿日期：2015-06-23；

修訂日期：2016-03-17

第一作者簡介：王曉玉(1989-)，女，碩士，從事水產(chǎn)動物繁殖生理學(xué)研究。E-mail:xyw7913@163.com 通訊作者：尹家勝。E-mail:xwsc20@tom.com

中圖分類號：S917.4

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)04-0019-06

Cloning,sequence analysis and tissue expression of insulin-like growth factor I in Hucho taimen

WANG Xiao-yu1,2,JI Feng1,2,XU Li-ming1,ZHAO Jing-zhuang1,LIU Miao1,CHAO Yong-sheng1,YIN Jia-sheng1

(1.HeilongjiangRiverFisheryResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Harbin150070,China;2.CollegeofFisheryandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

Abstract：Total RNA was isolated from Hucho taimen liver tissue.The cDNA encoding insulin-like growth factor I (IGF-I) peptide was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) strategy using isolated total RNA as template.The IGF-I mRNA level was detected in different tissues using real-time quantitative PCR technique.The results displayed that the IGF-I contained an open reading frame (ORF) of 573 bp,and encoded a polypeptide with length of 190 amino acids.The polypeptide was composed of signal peptide,B,C,A,D domain and E peptide and the isoelectric point was 9.21.The amino acid sequence of H.taimen IGF-I was high homologus to that of other Salmonidae. H.taimen shared the highest identity with Salvelinus alpinus and the homology at nucleotide level of the IGF-I gene was 99.2%.The expression analysis of IGF-I gene with real-time quantitative RT-PCR showed that the highest level of IGF-I mRNA was observed in liver,followed by in gill and anterior intestine.There was no obvious expression in brain,pronephros,spleen,heart,stomach and muscle.

Key words：Hucho taimen;IGF-I;evolutionary trees;tissue expression

資助項(xiàng)目：國家科技支撐計劃(2012BAD25B10)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201003055-14)