劉 徑，張珂恒，曾永三

?

昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)Oscheius myriophila共生細(xì)菌菌株B1的分離與鑒定

劉 徑，張珂恒，曾永三

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物保護(hù)系，廣東 廣州510225）

摘 要：從昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)（Oscheius myriophila）華農(nóng)種群HN體內(nèi)分離得到1株共生細(xì)菌B1。該菌株在NA培養(yǎng)基上形成的菌落為圓形，白色，表面光滑，不透明，隆起，邊緣整齊；革蘭氏陰性，短桿狀，單鞭毛，有熒光。Biolog檢測(cè)結(jié)果顯示B1為沙雷氏菌（Serratia sp.）；用引物27F/1492R進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到B1的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 1 445 bp。Blast搜尋和比對(duì)結(jié)果表明，該菌株16S rDNA序列與所選的17個(gè)嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌（S. nematodiphila）的相似度達(dá)97%～100%，并以高置信度（99）與這17個(gè)嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌種群及4個(gè)粘質(zhì)沙雷氏菌（S. marcescens）種群聚于1個(gè)單支系中。綜合形態(tài)和16S rDNA序列特征以及Biolog檢測(cè)結(jié)果，將共生細(xì)菌B1鑒定為嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌（Serratia nematodiphila）。

關(guān)鍵詞：共生細(xì)菌； 昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng) Oscheius myriophila； 16S rDNA；嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌

昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)共生菌發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)60年代，屬于腸桿菌科 （Enterobacteriaceae） 細(xì)菌。目前已報(bào)道的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)共生菌包括致病桿菌（Xenorhabdus sp.）［1］和光桿狀菌（Photorhabdus sp.）［2］及沙雷氏菌（Serratia sp.）［3］，它們分別與斯氏線蟲(chóng)屬（Steinernema）和異小桿線蟲(chóng)屬（Heterorhabditis）及小桿線蟲(chóng)屬（Oscheius 或Rhabditis）共生。共生細(xì)菌存在于三齡侵染期線蟲(chóng)的腸道內(nèi)，在昆蟲(chóng)血腔內(nèi)繁殖，產(chǎn)生毒素并分解昆蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使其患敗血癥死亡［4-5］。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)認(rèn)識(shí)到此類(lèi)共生細(xì)菌是一種抑菌［6］，是具有醫(yī)藥價(jià)值［7］的生物資源。在共生細(xì)菌的傳統(tǒng)分類(lèi)鑒定中，菌株間形態(tài)和生理生化指標(biāo)上的高度相似性，造成了分類(lèi)鑒定的困難。近年來(lái)，16S rDNA 序列分析在昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)共生細(xì)菌分類(lèi)鑒定上的應(yīng)用［8-9］，促進(jìn)了共生細(xì)菌的分類(lèi)和鑒定，已成為細(xì)菌系統(tǒng)分類(lèi)研究中最常用也是最有效的分子標(biāo)記。我們?cè)诮甑睦ハx(chóng)病原線蟲(chóng)調(diào)查中，通過(guò)大蠟螟誘集得到1個(gè)昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)種群，即華農(nóng)種群（Oscheius myriophila HN），從該線蟲(chóng)中分離得到1株共生細(xì)菌菌株（B1）?，F(xiàn)結(jié)合形態(tài)和分子特征以及Biolog分析結(jié)果，鑒定了該菌株，以期為該菌株的應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)的獲得

昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)的誘集、分離和保存采用劉志恒［10］的方法。

1.2共生細(xì)菌的分離培養(yǎng)

在無(wú)菌操作條件下，在體視鏡下挑取昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)接入鑒別培養(yǎng)基（NBTA）平板上，黑暗環(huán)境下培養(yǎng)48 h，即可獲得共生細(xì)菌。NBTA培養(yǎng)基含NB培養(yǎng)基〔牛肉膏3.00 g，蛋白胨 5.0 g，1 000 mL水，氯化三苯基四氮唑（TTC）0.04g，溴麝香百里酚蘭（BTB）0.025 g，瓊脂粉 12.0g〕，pH 為7.2～7.4。

1.3 共生細(xì)菌的純化和保存

在NBTA培養(yǎng)基平板上獲得共生細(xì)菌后，挑取單菌落進(jìn)行2次以上的劃線分離培養(yǎng)，并于NA斜面培養(yǎng)基［10］（牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖2.5 g，瓊脂18.0 g，水1 000 mL）培養(yǎng)保留備用。采用甘油管冷凍保藏法［11］，即挑取單菌落，無(wú)菌條件下接種到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，28℃在振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，吸取0.8 mL培養(yǎng)液，添加0.2 mL 80% 無(wú)菌甘油，混合。直接放到-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。使用時(shí)，可直接從冰箱中取出在平板上劃線培養(yǎng)，分離獲得單菌落。

1.4 共生細(xì)菌的活化培養(yǎng)

將保存的共生細(xì)菌菌株B1，在NA培養(yǎng)基上28℃活化培養(yǎng)3 d后，挑取單菌落即初生型菌落用于菌株鑒定。液體培養(yǎng)用NB培養(yǎng)基在28℃條件下振蕩培養(yǎng)24 h（大振幅恒溫?fù)u床，武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司，HQL150B），獲得細(xì)菌發(fā)酵液。

1.5 共生細(xì)菌的形態(tài)觀察

觀察細(xì)菌的菌落形態(tài)，以及是否產(chǎn)生熒光，并通過(guò)染色，在顯微鏡下觀察細(xì)菌的形狀、鞭毛及革蘭氏染色反應(yīng)［12］。

1.6 共生細(xì)菌的Biolog檢測(cè)

細(xì)菌的碳源利用情況通過(guò)Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)檢測(cè)。Biolog檢測(cè)方法為MS（i）/C027-C01（Biolog微生物鑒定系統(tǒng)鑒定程序），由廣東省微生物分析檢測(cè)中心完成。

1.7 昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)的分子特征分析

1.7.1 共生細(xì)菌DNA的提取 用細(xì)菌DNA提取試劑盒（廣州東盛生物科技有限公司）提取共生細(xì)菌DNA，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的DNA用于PCR擴(kuò)增或者于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 PCR擴(kuò)增 分別以大腸桿菌（Escherichia coli）16S rDNA的8～27位核苷酸27F（5' AGAG TTTGATCCTGGCTCAG 3'）和1 492～1 472位核苷酸1492R（5' ACGGCTACCTTGTTACGACTT 3'）［13］為正向引物和反向引物，以細(xì)菌DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在50 μL PCR反應(yīng)體系中含有：1 μL正向引物，1μL反向引物，20 μL ddH2O，25 μL2×Taq Green Mix DNA聚合酶 （含有TaqDNA聚合酶，dNTPs，Taq酶反應(yīng)緩沖液、穩(wěn)定劑和染料，由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)責(zé)任有限公司生產(chǎn)），3 μL 細(xì)菌 DNA 模板。反應(yīng)程序［14］為：95℃ 預(yù)變性 2 min，94℃ 變性40 s，56℃退火40 s，72℃ 延伸1 min，循環(huán)30次，最后 72℃ 延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用0.8% 瓊脂糖 （0.16 g瓊脂糖粉，0.7 μL Gold View，20 μL 1×TBE） 凝膠檢測(cè)，在0.5×TBE 電泳緩沖液（Tris-base 54.00 g，硼酸27.50 g，EDTA（0.5 mol/L，pH 8.0）20 mL，ddH2O 980 mL）中以電壓 2.4 V/cm電泳20 min，采用 Kodak GEL LOGIC 200 IMAGING SYSTEM 凝膠成像系統(tǒng)觀察和拍攝。

1.7.3 共生細(xì)菌16S rDNA測(cè)序及序列分析 將PCR產(chǎn)物由六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序部純化后，用3730全自動(dòng)測(cè)序儀（美國(guó)ABI公司）進(jìn)行測(cè)序。所得序列及與其高匹配的GenBank中的細(xì)菌序列經(jīng)ClustalW序列比對(duì)后，再利用MEGA5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析待鑒定共生細(xì)菌與相關(guān)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

2　結(jié)果與分析

2.1 共生細(xì)菌形態(tài)特征

待鑒定共生細(xì)菌B1在NA培養(yǎng)基上28℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)48 h后形成圓形單菌落，白色，表面光滑，不透明，隆起，邊緣整齊（圖1）。在顯微鏡下觀察，該菌為革蘭氏陰性，短桿狀，單鞭毛，有熒光。

A：?jiǎn)尉鋱D1 共生細(xì)菌（B1）在NA培養(yǎng)基上的菌落

2. 2 Biolog分析

Biolog檢測(cè)結(jié)果顯示，本研究共生細(xì)菌B1為沙雷氏菌（Serratia sp.），SIM=0.596。

2.3 分子生物學(xué)特征

2.3.1 PCR擴(kuò)增 用引物27F/1492R進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到共生細(xì)菌B1的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 445 bp。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

M：DNA Marker；1，2：B1的16S rDNA條帶圖2 共生細(xì)菌（B1）16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果

2.3.2 DNA序列比對(duì) 將待鑒定共生細(xì)菌B1的16S rDNA序列進(jìn)行Blast搜尋和比對(duì)，結(jié)果表明該菌株16S rDNA序列與所選的17個(gè)嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌（S. nematodiphila）的相似度達(dá)97%～100%，有0～8個(gè)堿基差異；與GenBank中的4個(gè)粘質(zhì)沙雷氏菌（S. marcescens）的相似度為97%～99%，有9～14個(gè)堿基差異；與深紅沙雷氏菌（S. rubidaea，AB004751）的相似度為96% ，有50個(gè)堿基差異；與沙雷氏菌（S. ureilytica，AJ854062）的相似度也為97% ，有27個(gè)堿基差異；與沙雷氏菌（S. odorifera，AF286870）的相似度也為96% ，有46個(gè)堿基差異；與沙雷氏菌（S. plymuthica，KJ729609）的相似度也為95%，有57個(gè)堿基差異； 與沙雷氏菌（S. proteamaculans，AB334771）的相似度也為95%，有70個(gè)堿基差異。

2.3.3 與相近種的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 從基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中可以看出：（1）所選的所有35個(gè)沙雷氏菌（Serratia spp.）以高置信度（91%）聚于1個(gè)單支系中；（2）本研究共生細(xì)菌B1和所選的17個(gè)嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌（S. nematodiphila）種群及4個(gè)粘質(zhì)沙雷氏菌（S. marcescens）種群以高置信度（99%）聚于1個(gè)單支系中，并與S. ureilytica（AJ854062）構(gòu)成姊妹支系；（3）共生細(xì)菌B1和所選的17個(gè)嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌種群與所選的4個(gè)粘質(zhì)沙雷氏菌種群親緣關(guān)系最近，與同屬的S. ureilytica（AJ854062）、S. rubiaea（AB004751）、S. odorifera （AF286870）、S. entomophila （AJ233427）、S. ficaria （AJ233428）種群親緣關(guān)系較近，而與另外6個(gè)種（S. plymuthica、S. symbiotica、S. fonticola、S. grimesii、S. quinivorans 和S. proteamaculans）的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；（4）嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌和粘質(zhì)沙雷氏菌與S. ureilytica 可能存在共同的祖先（圖3）。

綜合以上形態(tài)、Biolog和16S rDNA 序列分析結(jié)果，該菌株鑒定為嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌（Serratia nematodiphila），是一種隸屬于腸桿菌科的細(xì)菌。

3 結(jié)論與討論

分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析表明，本研究共生細(xì)菌B1與嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌（S. nematodiphila）的相似度高達(dá)97%～100% （有0 ～8個(gè)堿基差異），與粘質(zhì)沙雷氏菌（S. marcescens）的親緣關(guān)系最近，相似度達(dá)97%～99%（有9～14個(gè)堿基差異），但是共生細(xì)菌B1與粘質(zhì)沙雷氏菌在形態(tài)和生理特性有較大差異，如前者菌體生單根鞭毛，后者為周生鞭毛；前者菌落為白色，后者為紅色。因此，綜合形態(tài)特征觀察、Biolog檢測(cè)和16S rDNA 序列分析，分離自昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng) Oscheius （Rhabditis） myriophila體的共生細(xì)菌菌株B1鑒定為嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌S. nematodiphila。這是從昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng) O. myriophila體分離得到該共生細(xì)菌的首次報(bào)道。

沙雷氏菌中的粘質(zhì)沙雷氏菌（S. marcescens）是一種已知的昆蟲(chóng)病原。已報(bào)道從自然死亡的蝗蟲(chóng)體中分離得到的S. marcescens對(duì)蝗蟲(chóng)有致病性［15-16］。Tao等［16-17］報(bào)道，由 S. marcescens分泌的一些胞外蛋白例如核酸酶，磷脂酶，蛋白酶，溶血素涉及蝗蟲(chóng)的發(fā)病機(jī)理。 因而，S. marcescens被認(rèn)為是蝗蟲(chóng)的一種潛在的生防劑。Tambong［3］從小桿線蟲(chóng)（Rhabditis sp.） 中分離得到 1 個(gè) S. marcescens菌株，并經(jīng)測(cè)定顯示其對(duì)大蠟螟具有致病性。然而有關(guān)嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌（S. nematodiphila）及其殺蟲(chóng)活性的研究不多。Zhang等［18］從病蟲(chóng)病原線蟲(chóng)（Heterorhabditidoides chongmingensis，后被重新鑒定為Oscheius chongmingensis）體中分離得到嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌（S. nematodiphila），劉敬瑞［19］用大蠟螟初孵幼蟲(chóng)測(cè)定了該菌菌株（DZ0503SBS1T）的菌體及其胞外殺蟲(chóng)蛋白粗提物的殺蟲(chóng)活性，結(jié)果表明該菌對(duì)大蠟螟具有較高的毒力。本研究中的 S. nematodiphila是從通過(guò)大蠟螟誘集獲得的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng) O. myriophila 體中分離得到，該菌是否能致死大蠟螟等害蟲(chóng)或病原物及其致病機(jī)理還有待于深入研究。

圖3 基于16S rDNA序列構(gòu)建的共生細(xì)菌（B1）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

參考文獻(xiàn)：

［1］ Ferreira T，van Reenen C A，Endo A，Spr?er C，Malan A P，Dicks L M. Description of Xenorhabdus khoisanaesp. nov.，the symbiont of the entomopathogenic nematode Steinernema khoisanae［J］. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2013，63（9）：3220-4.

［2］ Ferreira T，van Reenen C A，Endo A，Tailliez P，Pagès S，Spr?er C，Malan A P，Dicks L M. Photorhabdus heterorhabditis sp. nov.，a symbiont of the entomopathogenic nematode Heterorhabditis zealandica［J］. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2014，64（5）：1540-5.

［3］ Tambong J T. Phylogeny of bacteria isolated from Rhabditis sp. Nematoda）and identification of novel entomopathogenic Serratia marcescens strains［J］. Current Microbiology，2013，66：138-144.

［4］ Martens E C，Heungens K，Goodrich-Blair H. Early colonization events in the mutualistic association between Steinernema carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria［J］. Journal of Bacteriology，2003，185：3147-3154.

［5］ Waterfield N R，Bowen D J，F(xiàn)etherson J D，et al. The toxin complex genes of Photorhabdus：a growing gene family［J］.Trends in Microbiology，2001，9：185-191.

［6］ 孫東磊，楊裕兵，匡石滋，等．發(fā)光桿菌Photorhabdus sp.1029發(fā)酵液抑菌活性研究［J］．廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，（15）：104-106．

［7］ 呂秋，簡(jiǎn)恒，劉衛(wèi)京，等．從嗜線蟲(chóng)桿菌分離的叫噪衍生物抗腫瘤活性的研究［J］．中國(guó)新藥雜志，2002，11（11）：850-852．

［8］ Liu J，Berry R E，Poinar G O Jr，et al. Phylogeny of Photorhabdus and Xenorhabdus species and strains as determined by comparison of partial 16S rRNA gene sequences［J］. International Journal ofSystematic Bacteriology，1997，41：948-951.

［9］ Liu J，Berry R E，Blouin M. Detection and identification of symbiotic bacteria（Photorhabdus and Xenorhabdus）from entomopathogenic nematodes（Heterorhabditis and Steinernema）［J］. Journal of Invertebrate Pathology，2001，77：87-91.

［10］ 劉志恒.現(xiàn)代微生物學(xué) ［M］．第2版.北京：科學(xué)出版社，2008.

［11］ 朱旭芬. 現(xiàn)代微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.杭州：浙江大學(xué)出版社，2011.

［12］ 劉芬，趙韶星. 革蘭氏染色三步法［J］. 山西職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，2（1）：54-56.

［13］ Lane D J. 16S/23S rRNA sequencing// Stackebrandt E，Goodfellow M（eds.）Nucleic acid techniques in bacterial systematics［M］. New York，NY，John Wiley，1991.

［14］ 孟現(xiàn)東，陳益泰. 楓香DNA提取方法與PCR擴(kuò)增程序的優(yōu)化［J］. 林業(yè)科學(xué)研究，2004，17（1）：42-46.

［15］ 馮書(shū)亮，曹偉平，范秀華，王蓉燕，Tsuguo M. 一株粘質(zhì)沙雷氏菌菌株的鑒定及對(duì)黃脛小車(chē)蝗的毒力測(cè)定［J］. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2002，18（2）：158-161.

［16］ Tao K，Long Z，Liu K，et al.. Purification and properties of a novel insecticidal protein from the locust pathogen Serratia marcescens HR-3［J］. Current Microbiology，2006，52：45-49.

［17］ Tao K，Yu X，Liu Y，et al. Cloning，expression，and purification of insecticidal protein Pr596 from locust pathogen Serratia marcescens HR-3［J］. Current Microbiology，2007，55：228-233.

［18］ Zhang C X，Yang S Y，Xu M X，et al. Serratia nematodiphila sp. nov.，associated symbiotically with the entomopathogenic nematode Heterorhabditidoides chongmingensis（Rhabditida； Rhabditidae）［J］. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2009，59：1603-1608.

［19］ 劉敬瑞．嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌菌株DZ0503SBS1T殺蟲(chóng)活性相關(guān)生物學(xué)特征及殺蟲(chóng)毒素蛋白的分離純化［D］. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009．

（責(zé)任編輯 楊賢智）

中圖分類(lèi)號(hào)：S476.15

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-874X（2016）03-0111-05

收稿日期：2015-10-19

基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B020308010）

作者簡(jiǎn)介：劉徑（1990-），女，在讀碩士生，E-mail： 645521113@qq.com

通訊作者：曾永三（1965-），男，博士，教授，E-mail：zys65@163.com

Isolation and identification of a symboiotic bacterial strain （B1）from an entomopathogenic nematode， Oscheius myriophila

LIU Jing，ZHANG Ke-heng，ZENG Yong-san
（Department of Plant Protection， Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225， China）

Abstract：A symbiotic bacterial strain designated as B1 was isolated from an entomopathogenic nematode，Oscheius myriophila HN. The colonies formed on NA medium were round， white， smooth， opaque， convex and entire. The B1 cell is gram-negative， short rod-shaped， mono-flagellum and fluorescent. Biolog assay results showed that B1 belongs to the genus Serratia. The size of PCR amplification segment of B1 16S rDNA by using primers 27F/1492R is 1445 bp. BLAST search and alignment of the 16S rDNA sequence indicated that identities of the studied sequence and the selected 17 ones from S. nematodiphila populations reached 97% -100%， and B1 was clustered into a monophylogenetic clade with these 17 and four S. marcescens populations with high bootstraps （99）. The symbiotic strain B1 was identified as Serratia nematodiphila based on morphological and 16S rDNA sequence characteristics and Biolog test result.

Key words：symbiotic bacteria；entomopathogenic nematode Oscheius myriophila；16S rDNA；Serratia nematodiphila