張 倩，陳曉明，余昊，智元杰

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621010；2.西南科技大學(xué)核廢物與環(huán)境安全國防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，四川綿陽 621010)

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外源鈾脅迫對鈾礦區(qū)土壤環(huán)境質(zhì)量生物學(xué)指標(biāo)的影響

張 倩1，2，陳曉明1，2，余昊1，2，智元杰1，2

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621010；2.西南科技大學(xué)核廢物與環(huán)境安全國防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，四川綿陽 621010)

摘要[目的]考察二次鈾污染下鈾礦區(qū)土壤功能的變化情況。[方法]對鈾礦區(qū)的土壤樣品進(jìn)行不同濃度外源鈾脅迫處理，對相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行測定。[結(jié)果]原土壤主要受砷、鎘、鈾的復(fù)合污染，外源鈾脅迫濃度增加，使土壤微生物數(shù)量減少，對土壤葡萄糖酶、過氧化氫酶和脲酶的活性具有不同程度的抑制作用，與土壤代謝熵呈顯著正相關(guān)，而與微生物生物量碳、微生物生物量氮、微生物熵均呈顯著負(fù)相關(guān)。[結(jié)論]土壤環(huán)境質(zhì)量生物學(xué)指標(biāo)可以表征重金屬脅迫下土壤環(huán)境質(zhì)量的變化情況。

關(guān)鍵詞重金屬；鈾；生物學(xué)指標(biāo)；酶

近年來，土壤重金屬污染是環(huán)境科學(xué)的一個(gè)熱點(diǎn)研究方向。重金屬污染不僅使生態(tài)環(huán)境質(zhì)量遭受損害，還會(huì)對人畜健康產(chǎn)生不利影響。評估遭受重金屬污染的土壤環(huán)境質(zhì)量時(shí)，一般采用重金屬的總量指標(biāo)和有效量指標(biāo)[1]，但是總量指標(biāo)難以全面反映土壤重金屬的生物有效性，而有效量指標(biāo)受到測定方法差異等諸多因素的限制，可比性較差。因此，可以采用土壤環(huán)境質(zhì)量生物學(xué)指標(biāo)[2]反映土壤重金屬的污染狀況。研究表明，微生物生物量、土壤酶活性、微生物熵、代謝熵等土壤質(zhì)量生物學(xué)指標(biāo)對自然和人為活動(dòng)引起的外界條件變化很敏感。代謝熵是指單位重量微生物生物量碳的呼吸量值，它把微生物生物量的大小和微生物的生物活性和功能有機(jī)結(jié)合，反映了微生物群落的生理特征[3]；微生物熵是指土壤微生物生物量碳和總有機(jī)碳的比值，可以作為反映重金屬污染對土壤生態(tài)產(chǎn)生影響的較好指標(biāo)[4]。

研究表明，可以通過土壤微生物生物量、土壤酶活性和微生物熵來表征土壤受重金屬污染程度。一般認(rèn)為，重金屬污染能引起微生物生物量的下降，而土壤呼吸量的增加被認(rèn)為是微生物對逆境的一種反應(yīng)機(jī)理[5]。Fliebbach等[6]研究認(rèn)為，代謝熵可用于指示土壤重金屬污染對微生物的影響程度，揭示土壤發(fā)生過程、基質(zhì)質(zhì)量、生態(tài)演變以及對環(huán)境脅迫的反應(yīng)。國內(nèi)外對這類課題的研究多針對旱地土壤，土壤原位重金屬的污染效應(yīng)，以及通過外源添加重金屬模擬污染土壤。筆者通過對川西北某鈾礦區(qū)污染土壤樣品中添加外源鈾，研究重金屬復(fù)合污染與土壤生物學(xué)指標(biāo)之間的內(nèi)在聯(lián)系，了解重金屬污染對土壤質(zhì)量的影響，以期為評估鈾的二次污染情況提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣品采集樣品采集于2014年8月在若爾蓋礦區(qū)(102°45′～102°46′ E，34°12′～34°13′ N)進(jìn)行。選擇TY1、TY2和TY33個(gè)采樣位點(diǎn)在同一污染帶的土壤樣品進(jìn)行研究。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)土壤脅迫處理采取向供試土壤中添加外源鈾的方式。根據(jù)前期對該鈾礦區(qū)鈾污染現(xiàn)狀的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)土壤總鈾濃度為30～180 mg/kg(干土)，因該供試土壤的本底鈾濃度為87.93 mg/kg，因此，將外源鈾脅迫濃度分別設(shè)為10、50、100和200 mg/kg(干土)，以原土樣作為空白對照。試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，每處理土壤樣品用量為100.0 g，置于25 ℃下培養(yǎng)，脅迫時(shí)間為14 d，保持土壤水分為最大田間持水量的60%，每處理3次重復(fù)(表1)。選用醋酸雙氧鈾[UO2(CH3COO2)2·2H2O，分析純，湖南楚勝威化工]為鈾原料，根據(jù)鈾的含量配制成1%的溶液，備用。

1.3培養(yǎng)基制備

1.3.1細(xì)菌培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基：酵母浸出粉5.00 g，蛋白胨10.00 g，NaCl 10.00 g，瓊脂15.00 g，去離子水定容至1 000 mL，pH 7.2～7.4。

1.3.2真菌培養(yǎng)基。馬丁氏孟加拉紅培養(yǎng)基：KH2PO41.00 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，蛋白胨 5.00 g，葡萄糖10.00 g，瓊脂20.00 g，去離子水定容至1 000 mL，pH 自然。在煮開的培養(yǎng)基中每1 000 mL加1%孟加拉紅水溶液3.3 mL，臨用時(shí)每100 mL培養(yǎng)基中加1%鏈霉素液0.3 mL。

表1　外源鈾脅迫的處理方式

1.3.3放線菌培養(yǎng)基。高氏一號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20.00 g，KNO31.00 g，K2HPO40.50 g，MgSO4· 7H2O 0.50 g，NaCl 0.50 g，F(xiàn)eSO4· 7H2O 0.01 g，瓊脂 20.00 g，去離子水定容至1 000 mL，pH 7.4～7.6。

1.4測定項(xiàng)目與方法砷、鎘、鉻、銅、鉛、鋅、鈾含量采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICAP6500，Thermo Scitific)測定；土壤 pH采用水土比2.5∶1 測定；土壤有機(jī)質(zhì)含量釆用H2SO4-K2CrO7外加熱法測定；過氧化氫酶活性采用Johnson與Temple法測定[7]；脲酶活性和葡萄糖酶活性的測定方法參照《土壤酶學(xué)》[7]；土壤微生物生物量碳和土壤微生物生物量氮含量采用熏蒸浸提法測定[8]；浸提液中的氮含量采用凱氏消煮法測定[9]。

土壤基礎(chǔ)呼吸的測定：稱取50.00 g鮮土置于150 mL三角瓶中，將裝有5 mL濃度為1 mol/L氫氧化鈉溶液的小吸收瓶放在三角瓶中，加蓋密封，于25 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，取出氫氧化鈉吸收瓶，加入2 mL 0.5 mol/L BaCl2及酚酞指示劑，用稀鹽酸滴定至無色，測定吸收的二氧化碳含量，即為土壤微生物呼出的二氧化碳。同時(shí)做空白對照試驗(yàn)。

鈾脅迫土壤中微生物數(shù)量的測定：稱取5.00 g土壤樣品置于45 mL帶玻璃珠的滅菌生理鹽水中，在120 r/min、37 ℃條件下震蕩24 h，取出，吸取0.5 mL懸液，加入到4.5 mL滅菌的生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，采用螺旋接種儀(AP5000，Spiral Biotech)將稀釋液分別均勻涂布到細(xì)菌、真菌和放線菌3種固體培養(yǎng)基上。分別記錄每個(gè)樣品中各類微生物的數(shù)量，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差的對數(shù)值表示。

1.5數(shù)據(jù)分析采用Origin 8.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用SPSS 22.0進(jìn)行主成分分析。

2結(jié)果與分析

2.1土壤重金屬含量由表2可知，同一來源的土壤，通過不同濃度外源鈾脅迫處理后，土壤樣品浸出液pH小于7.00，呈中性或弱酸性；同一外源鈾處理中，隨著外源鈾脅迫濃度的增加，有機(jī)碳和水解氮含量降低，而全氮、全碳含量無顯著變化，說明土壤中參與碳循環(huán)和氮循環(huán)的微生物由于外源鈾的脅迫導(dǎo)致生長代謝異常。

由表2可知，該地區(qū)土壤pH低于6.50，根據(jù)《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[10](GB 15618—1995)二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)綜合分析可知(表3、4)，所有供試土壤中砷含量超出標(biāo)準(zhǔn)值10倍以上，鎘含量超出背景值30倍，TY2樣品中銅和鋅含量超出背景值。全國土壤鈾的背景含量中位值是2.72 mg/kg[11]，供試土壤鈾含量超過10倍以上。這表明供試土壤中砷、鎘、鈾、銅和鋅都有一定程度的污染。其中，砷、鎘、鈾是主要污染元素。

表2　3個(gè)采樣點(diǎn)土壤基本理化性質(zhì)

表3　3個(gè)采樣點(diǎn)土壤重金屬含量

表4　土壤重金屬質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2.2外源鈾脅迫下的土壤微生物分布從圖1可見，重金屬脅迫與土壤微生物數(shù)量有密切關(guān)系，隨著脅迫濃度的增加，各處理土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量均呈下降趨勢，其中，TY2組的細(xì)菌變化最顯著，TY3組的真菌變化最顯著，TY1組的放線菌變化最顯著。也有部分受到10 mg/kg外源鈾處理的土壤微生物數(shù)量比CK稍多，如TY3的真菌數(shù)量。TY1、TY2、TY33個(gè)處理受200 mg/kg外源鈾脅迫的土壤中真菌數(shù)量比同組CK分別降低了83%、71%、37%；其次是細(xì)菌，各組受200 mg/kg外源鈾脅迫的土壤中細(xì)菌數(shù)量比CK分別降低了42%、24%、28%；放線菌受外源鈾脅迫的影響不大，各組受200 mg/kg外源鈾脅迫的土壤放線菌數(shù)量分別降低了23%、11%、18%。這與該地區(qū)細(xì)菌、真菌和放線菌對地表γ輻射敏感性的規(guī)律相類似。

圖1　不同濃度外源鈾脅迫下土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量Fig.1　The number of bacteria，fungi and antinomycetes in soil under different concentrations of exogenous uranium pollution

2.3外源鈾脅迫下的土壤代謝活性由表5可知，外源鈾脅迫對土壤微生物生物量碳、微生物生物量氮的影響密切，分別為549.32～2 546.39和70.31～129.93 mg/kg。隨著外源鈾脅迫濃度的增加，土壤微生物生物量碳、微生物生物量氮均有明顯的降低趨勢。相關(guān)分析表明，微生物生物量碳、微生物生物量氮與砷、鎘、鈾均呈顯著性負(fù)相關(guān)(表6)。微生物熵隨著外源鈾脅迫濃度的增加而降低，與砷、鎘、鈾均呈顯著性負(fù)相關(guān)。土壤微生物C/N的變化范圍是5.73～15.34 mg/kg，與砷、鎘、鈾的相關(guān)性系數(shù)分別為-0.649、-0.243、-0.783，說明重金屬污染能在一定程度上影響微生物C/N。此外，土壤代謝熵與砷、鎘、鈾含量呈顯著正相關(guān)。2.4外源鈾脅迫下的土壤酶活性由表7可知，重金屬復(fù)合污染對土壤葡萄糖酶和脲酶活性均有不同程度的抑制作用。葡萄糖酶活性為5.97～9.32 mg/g，脲酶活性為0.070～0.149 mg/g，過氧化氫酶活性為1.81～2.03 ml/L。相關(guān)分析表明，葡萄糖酶和脲酶活性與土壤重金屬呈顯著負(fù)相關(guān)(表6)，說明葡萄糖酶和脲酶在一定條件下可以反映土壤重金屬的污染程度。過氧化氫酶活性與土壤重金屬有一定的負(fù)相關(guān)趨勢，這可能與土壤類型有關(guān)。

3討論

3.1外源鈾脅迫對土壤生物學(xué)指標(biāo)的影響土壤微生物生物量碳和微生物生物量氮是表征土壤環(huán)境質(zhì)量的生物學(xué)指標(biāo)。一般而言，土壤微生物生物量碳和土壤微生物生物量氮與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈極顯著正相關(guān)。但在該研究中，土壤微生物生物量碳、微生物生物量氮與總有機(jī)碳的相關(guān)性不顯著。這與何振立[12]的觀點(diǎn)一致，即在遭受重金屬污染的土壤中，土壤微生物生物量和土壤有機(jī)碳含量之間的相關(guān)性不存在或很差。

微生物生物量碳和微生物生物量氮與土壤重金屬含量均呈顯著負(fù)相關(guān)，這與很多報(bào)道相符，如Mcgrath[13]研究發(fā)現(xiàn)，長期受重金屬污染的土壤，微生物生物量有下降趨勢。Cotrufo[14]研究表明，受重金屬污染的土壤微生物生物量和真菌生物量明顯比未受污染土壤中低。重金屬脅迫使微生物生物量降低，這可能是由于重金屬污染影響了細(xì)胞正常的新陳代謝，從而影響了微生物的生理功能，使微生物的生存力和競爭力減弱，從而導(dǎo)致微生物遺傳多樣性的改變。

微生物熵隨著鈾含量的增加有顯著的降低趨勢，可能是由于重金屬污染嚴(yán)重影響了微生物群落的大小和微生物對基質(zhì)的利用率[15]。這與Fliebbach等[6]的研究結(jié)果一致。然

表5　3個(gè)采樣點(diǎn)不同濃度外源鈾脅迫下的土壤微生物學(xué)指標(biāo)

表6　外源鈾脅迫下土壤重金屬與土壤環(huán)境質(zhì)量生物學(xué)指標(biāo)之間的相關(guān)系數(shù)

注：*表示在0.05水平顯著性相關(guān)；**表示在0.01水平顯著性相關(guān)。

Note: * stands for significant correlation at 0.05 level; ** stands for significant correlation at 0.01 level.

表7　3個(gè)采樣點(diǎn)不同濃度外源鈾脅迫下的土壤酶活性

而，Insam[16]研究表明，微生物熵在重金屬污染地和非重金屬污染地含量很高，這可能是由于土壤類型差異較大。

微生物C/N隨著重金屬污染濃度的增加而降低，這與很多其他同類研究不一致。Khan等[17]研究表明，隨著重金屬含量的提高，微生物C/N有明顯的上升趨勢[17]，這可能是由有耐受性真菌生物量的增加所致。研究結(jié)果不一致可能是由于重金屬污染土壤中，微生物種群的變化并非同一規(guī)律，同時(shí)還受其他因素(如土壤本身性質(zhì))的影響。

代謝熵與砷、鎘、鈾均達(dá)顯著正相關(guān)水平，說明環(huán)境脅迫能使代謝熵增加。Anderson等[18]研究表明，土壤中加重金屬后能顯著提高代謝熵[18]，這一現(xiàn)象可能是由微生物能量保持極低的基質(zhì)利用率引起。而Boath等[19]研究發(fā)現(xiàn)，隨著重金屬濃度的增加，代謝熵反而有輕微降低，揭示了代謝熵可能與土壤質(zhì)地、有機(jī)質(zhì)含量、土壤pH等因素有關(guān)。

3.2外源鈾脅迫對土壤酶活的影響土壤酶對環(huán)境因素引起的變化較敏感，具有良好的時(shí)效性特點(diǎn)。史長青[20]通過重金屬元素含量和過氧化氫酶、脲酶的相關(guān)分析，得出了2種酶均與重金屬污染程度呈顯著負(fù)相關(guān)的結(jié)論。劉樹慶[21]對保定市污灌區(qū)土壤的鉛、鎘污染與土壤酶活性關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，土壤脲酶和過氧化氫酶活性隨著鉛、鎘含量的增加有明顯的降低。筆者研究表明，重金屬復(fù)合污染對過氧化氫酶、腺酶、葡萄糖酶的抑制機(jī)理可能與重金屬抑制微生物的生長代謝有關(guān)，從而減少微生物體內(nèi)酶的合成與分泌，最終導(dǎo)致土壤酶活性下降。但也有學(xué)者認(rèn)為，重金屬對酶活性的抑制主要通過重金屬與底物結(jié)合、重金屬和酶蛋白的活性部位結(jié)合，或者重金屬與酶一底物復(fù)合體結(jié)合[22]。然而，重金屬復(fù)合污染對土壤酶活性復(fù)雜的交互作用機(jī)理目前尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

該研究結(jié)果表明，重金屬脅迫與土壤微生物的種類和數(shù)量有著密切聯(lián)系，隨著鈾濃度的增加，細(xì)菌、真菌、放線菌均有不同程度的減少，其中，真菌減少的比例最大，其次是細(xì)菌和放線菌。鈾含量的增加，鈾的放射性毒性和化學(xué)性毒性也增強(qiáng)，影響了微生物正常的生理功能，側(cè)面佐證了該研究中土壤生物學(xué)指標(biāo)的一些變化規(guī)律。

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基金項(xiàng)目西南科技大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(15ycx088)；核廢物與環(huán)境安全國防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目(15yyhk05)；國家973計(jì)劃項(xiàng)目(2014CB846003)；國防科技項(xiàng)目(14zg6101)。

作者簡介張倩(1989- )，女，四川成都人，碩士研究生，研究方向：重金屬與微生物群落相互作用。

收稿日期2016-04-25

中圖分類號(hào)S 154

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)15-202-05

Effects of Exogenous Uranium Pollution on Soil Biological Indicators of Environmental Quality in Uranium Mining Area

ZHANG Qian1,2, CHEN Xiao-ming1,2, YU Hao1,2et al

(1. School of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang, Sichuan 621010; 2. National Defense Key Laboratory of Nuclear Waste and Environmental Safety, Southwest University of Science and Technology, Mianyang, Sichuan 621010)

Abstract[Objective] The aim was to investigate the change of soil functions under the second uranium contamination in the uranium mining area. [Method] Different concentrations of exogenous uranium stress was conducted on soil samples from uranium mining area, the relevant biological indicators were determined. [Result] The result showed that the main heavy metal elements found in the polluted area were As, Ge and U. The increasing concentration of exogenous uranium pollution inhibited the microbial quantity, glucose enzyme activity, catalase activity and urease activity to different extent. A significant positive correlation was shown to exist between exogenous uranium pollution and soil metabolic quotient whereas a negative correlation between exogenous uranium pollution and microbial biomass carbon, microbial biomass nitrogen as well as microbial quotient. [Conclusion] These biological indicators can express the evolution of soil environmental quality under the exogenous heavy metal pollution.

Key wordsHeavy metal; Uranium; Biological indicator; Enzyme