姚桂桂， 劉 凱， 謝 楠， 馮曉宇

(杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江杭州 310024)

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黃尾鲴不同組織中LDH同工酶的研究

姚桂桂， 劉 凱， 謝 楠， 馮曉宇

(杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江杭州 310024)

摘要[目的]研究黃尾鲴不同組織的LDH同工酶。[方法]采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳技術和特異性染色方法對黃尾鲴的肝、腎、眼、心4種組織的LDH同工酶進行分析。[結果]酶譜的表達具有明顯的組織特異性。酶帶由3個基因座位(LDH-A、LDH-B、LDH-C)編碼，在4種組織中共檢測到14條帶，其中，心和腎7條帶，眼6條帶，肝14條帶。在PAGE膠趨向陰極側檢測到6條肝臟組織所特有的LDH-C基因編碼帶。在各組織LDH酶帶表達活性上，心中LDH-2、LDH-3和LDH-5表達占優(yōu)勢，腎中LDH-2、LDH-7和LDH-3表達占優(yōu)勢，肝中LDH-13、LDH-9和LDH-12表達占優(yōu)勢，眼中LDH-5、LDH-2和LDH-7表達占優(yōu)勢。[結論]該研究為豐富黃尾鲴遺傳學基礎研究、遺傳育種種質標準的建立和種群生化遺傳結構分析提供科學依據(jù)。

關鍵詞黃尾鲴；同工酶；乳酸脫氫酶

黃尾鲴(Xenocyprisdavidi)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(cyprinidae)鲴亞科(Xenocyprininae)鲴屬(Xenocypris)，俗稱黃尾巴、黃片、黃姑子、黃瓜魚等，廣泛分布于我國黃河流域以南各水系，在江河、湖泊、水庫中均有分布，屬底棲型魚類，主要以底層藻類、腐殖質等為食[1]。由于其底棲刮食性的特點，黃尾鲴對水體生態(tài)環(huán)境改善、水質改良具有較好的促進作用，是目前人工增殖放流、池塘混養(yǎng)的理想品種。另因其肉質細膩、味道鮮美，黃尾鲴也是較受消費者歡迎的特色魚類品種之一。目前，黃尾鲴規(guī)?；绶N繁育及養(yǎng)殖技術已較成熟，人工養(yǎng)殖已形成一定規(guī)模，但對于黃尾鲴同工酶的研究鮮見報道。

同工酶是由生物體內基因組編碼，催化某類生化反應，而本身分子結構有所不同的一組酶，它把宏觀的遺傳現(xiàn)象聯(lián)系到微觀的分子水平，從基因的產(chǎn)物認識基因的存在及表達，通過研究同工酶的結構、功能、調控，了解從物種的基因到物種的性狀的中間過程[2]。目前，同工酶技術已被廣泛應用于遺傳系統(tǒng)進化[3]、個體發(fā)育[4]、雜交育種[5]以及病理和生理[6]等方面的研究。筆者對黃尾鲴4種不同組織的LDH同工酶進行研究，旨在了解其生理生化等生物學特性，為豐富黃尾鲴遺傳學基礎研究、遺傳育種種質標準的建立和種群生化遺傳結構分析提供科學依據(jù)。

1材料方法

1.1試驗材料試驗用魚為杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院保存的采集自錢塘江、福建清流以及湖南醴陵等地的黃尾鲴, 未分雌雄，體重在50～150 g，每2尾制備同工酶混合樣品，重復3次。

1.2試驗方法

1.2.1同工酶的提取。將魚解剖，取肝、腎、心、眼等組織，PBS沖洗去除血漬，按體積比1∶4加入提取緩沖液(0.05 mol/L pH 6.8 Tris-HCL緩沖液)，冰上用玻璃勻漿器進行組織勻漿后，轉入1.5 mL離心管，4 ℃ 9 755 r/min離心30 min，吸取上清液至新的離心管中，-20 ℃保存。

1.2.2電泳及染色。采用不連續(xù)聚丙烯酰胺非變性凝膠垂直電泳，進行乳酸脫氫酶(LDH)同工酶分析，電泳及染色方法參照國標方法進行[7]。濃縮膠濃度為3.75%，pH 6.8，分離膠濃度為6.5%，pH 8.8。每個加樣槽加樣5 μL(樣品上樣液∶5×上樣緩沖液=4∶1)，200 V恒壓電泳5～6 h。

1.2.3結果記錄。凝膠經(jīng)染色、固定后置Gel DocTMXR+凝膠成像分析系統(tǒng)(美國 BIO-RAD公司)進行拍照及圖譜掃描。根據(jù)膠片繪制模式圖，掃描數(shù)據(jù)用SPSS 13.0 for Windows 軟件進行分析。

1.2.4同工酶命名及分析。同工酶的縮寫、基因座位和等位基因的命名基本參照Shakelee等[8]和Whitmore[9]的方法，即以同工酶名稱縮寫的大寫代表酶蛋白，小寫代表編碼基因。控制同一種酶的不同基因座位據(jù)其相對遷移率Rf由大到小依次編號為1、2、3……，酶帶分析參考熊全沫[10-11]的方法。

2結果與分析

2.1不同組織LDH同工酶譜的表達特性對黃尾鲴4種組織LDH同工酶的PAGE電泳圖譜及其相應的模式圖進行分析，結果顯示，酶譜的表達具有明顯的組織特異性：在4種組織中共檢測到 14條帶，從陽極端到陰極端依次編號為LDH-1、LDH-2、LDH-3、LDH-4、LDH-5、LDH-6、LDH-7、LDH-8、LDH-9、LDH-10、LDH-11、LDH-12、LDH-13和LDH-14，心和腎7條帶，眼6條帶，肝14條帶，其中，LDH-2、LDH-3、LDH-5、LDH-6和LDH-7在心、腎和眼中均有表達，且各酶帶遷移率非常相似，僅不同組織的酶帶活性強弱不同。眼中未檢測到LDH-8，而在其他組織中均有表達。在PAGE膠趨向陰極側檢測到6條肝所特有的酶帶：LDH-9、LDH-10、LDH-11、LDH-12、LDH-13和LDH-14。此外，與其他組織相比，肝中缺失LDH-4酶帶，但特有LDH-1酶帶。

2.2不同組織LDH同工酶相對百分含量利用凝膠成像分析系統(tǒng)對各組織LDH同工酶進行酶譜掃描及百分比分析，結果見圖2和3。由圖2和3可知，心中LDH-2、LDH-3和LDH-5表達占優(yōu)勢，腎中LDH-2、LDH-7和LDH-3表達占優(yōu)勢，肝中LDH-13、LDH-9和LDH-12表達占優(yōu)勢，眼中LDH-5、LDH-2和LDH-7表達占優(yōu)勢。對于典型的由A、B 2個亞基組成的4聚體LDH的5條譜帶的電泳圖，可以對組成A、B亞基的表達優(yōu)勢進行分析，但由于黃尾鲴各組織中LDH均未表現(xiàn)為典型的5譜帶的電泳圖譜，對亞基分析比較困難。

注：H.心臟; K.腎臟; L.肝臟;E.眼。Note:H, K, L and E present heart, kidney, liver and eyes, respectively.圖1　黃尾鲴不同組織LDH同工酶的電泳圖及其相應的模式圖Fig.1　Electrophoretogram and model graph of LDH isozyme expressed in various tissues of Xenocypris davidi

圖2　黃尾鲴不同組織LDH同工酶譜帶掃描圖Fig.2　The spectral band scan of the LDH isozyme in different tissues of Xenocypris davidi

圖3　黃尾鲴不同組織LDH同工酶相對百分含量Fig.3　Relative percentage content of the LDH isozyme in different tissues of Xenocypris davidi

3討論

3.1黃尾鲴LDH同工酶酶譜分析關于黃尾鲴LDH同工酶的研究已有報道，最早見于朱藍菲[5]的研究，朱藍菲[5]研究結果表明，黃尾密鲴的心、腎和晶狀體等組織LDH均由3條譜帶組成。朱藍菲等[3]進一步探討了鯉科魚類LDH同工酶的表型差異并指出眼(晶狀體)的LDH同工酶較穩(wěn)定，能代表各種魚的LDH表型。曹麗琴等[12]研究中國鲴亞科魚類同工酶和骨骼特征及系統(tǒng)演化，結果顯示，肝LDH同工酶譜帶較多，腎臟、眼睛、腦及心臟等組織均由5條譜帶組成。楊品紅等[13]研究了與黃尾鲴分類地位相近的細鱗斜頜鲴的LDH同工酶，指出細鱗斜頜鲴腦、腎、心和眼4種組織中LDH同工酶只有3條LDH譜帶，而肝中有7條帶，肌肉中有1條超顯性帶。

在該試驗過程中發(fā)現(xiàn)，黃尾鲴肝、腎及心等組織中LDH同工酶的譜帶較多且電泳圖譜不穩(wěn)定，尤其是肝組織的LDH電泳圖譜。造成同工酶酶譜差異的原因，一方面可能是由于在同一種魚不同組織中酶的編碼基因(如A和B)不是同時表達，造成組織之間酶譜帶數(shù)量的不同；另一方面，即使編碼基因同時表達，但編碼基因活性表現(xiàn)程度不同，或者基因表達后由于各種組織執(zhí)行不同生理功能，酶受到不同因子的調控，造成各組織間同工酶含量或活性的差異，因而形成酶譜帶強弱的差異[14]。此外，雜蛋白的存在及樣品制備、保存等問題，也是造成同工酶酶譜差異的原因。相對于其他組織，眼(晶狀體) LDH的譜帶則相對較穩(wěn)定，多次重復試驗結果未見差異。但眼(晶狀體)LDH同工酶譜帶不同于已報道文獻[3,12]由5條譜帶組成，是由6條譜帶組成。試驗樣品送農(nóng)業(yè)部淡水魚類種質監(jiān)督檢驗測試中心(武漢)復檢，結果顯示，黃尾鲴眼LDH同工酶譜帶由6條譜帶組成，且肝、心和腎等組織LDH酶譜與該試驗結果基本一致。由此可知，LDH同工酶在各組織中表達穩(wěn)定性存在差異，且由于樣品制備、處理等差異，造成試驗結果差異。但相對于其他組織，眼(晶狀體) LDH的譜帶則相對較穩(wěn)定，可以作為種質鑒定的特征之一。

3.2黃尾鲴LDH同工酶特異譜帶分析魚類LDH同工酶中常檢測到特異帶，如粗唇鮠[15]酶譜A3B1處存在一條同分異構體，錦鯉和紅鯉[16]的肌肉中LDH-B基因位點出現(xiàn)新的等位基因LDH-B′，但變異最大的是C帶。一般認為，C帶是由LDH-C或LDH-X[17]編碼。C帶變異主要體現(xiàn)在3個方面[13]：表達的部位；在PAGE膠中的顯帶部位；C帶表達

條數(shù)。該試驗中，在PAGE膠趨向陰極側檢測到6條肝所特有的酶帶：LDH-9、LDH-10、LDH-11、LDH-12、LDH-13和LDH-14。推測是編碼區(qū)產(chǎn)生了LDH-C的新等位基因LDH-C′，或者LDH-C和LDH-A或LDH-B形成了雜合四聚體。此外，在黃尾鲴各組織中未發(fā)現(xiàn)LDH同工酶酶譜的5條典型酶帶，可能是LDH-A或LDH-B產(chǎn)生了同分異構體，其原因有待于進一步研究。

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基金項目2014年農(nóng)業(yè)行業(yè)(水產(chǎn))標準制定。

作者簡介姚桂桂 (1983- ), 女,浙江天臺人，工程師，碩士，從事水產(chǎn)繁育與養(yǎng)殖研究。

收稿日期2016-04-16

中圖分類號S 917

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)15-135-03

Study on LDH Isozyme in Different Tissues ofXenocyprisdavidi

YAO Gui-gui, LIU Kai, XIE Nan et al

(Hangzhou Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou, Zhejiang 310024)

Abstract[Objective] The aim was to study LDH isozyme in different tissues of Xenocypris davidi.[Method] By using vertical polyacrylamide gel electrophoresis and specific dye measures, LDH isozyme in 4 tissues (liver, kidney, eye and heart) of Xenocypris davidi was studied.[Result] The results showed that the electrophoretogram of LDH isozyme patterns exhibited remarkable tissue specificities.14 LDH isozyme bands encoded by LDH-A, LDH-B, LDH-C loci were detected from all the 4 tissues.7 bands were found in heart and kidney, 6 bands were found in eye, and 14 bands were found in liver.6 specific bands encoded by LDH-C were detected on the cathode side of PAGE hectograph within liver.According to activity of LDH isozyme in tissues, LDH-2, LDH-3 and LDH-5 were preponderantly expressing in heart, LDH-2, LDH-7 and LDH-3 were preponderantly expressing in kidney, LDH-13, LDH-9 and LDH-12 were preponderantly expressing in liver, and LDH-5, LDH-2 and LDH-7 were preponderantly expressing in eye.[Conclusion] The study provides a scientific basis for enrichment of genetic basis research, establishment of genetic breeding germplasm standard and analysis of population biochemical genetic structure.

Key wordsXenocypris davidi; Isozyme; Lactate dehydrogenase