黃 丹，叢 喆，徐 珮，薛 婧，魏 強

（北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

?

研究報告

游離SIVmac239病毒與T細胞介導兩種方式感染內(nèi)皮細胞的效果比較

黃 丹，叢 喆，徐 珮，薛 婧，魏 強

（北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

【摘要】目的 比較游離病毒感染與T細胞介導的感染方式對SIV感染內(nèi)皮細胞的影響，探索SIVmac239感染內(nèi)皮細胞的主要途徑，從而為SIV入侵血腦屏障的機制提供理論基礎。方法 采用游離SIV病毒直接感染內(nèi)皮細胞和SIV感染的CEMx174細胞與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)的兩種方式，通過巢式PCR、間接免疫熒光法、Western blotting以及ELISA檢測內(nèi)皮細胞的感染程度。結果 兩種感染方式都能在內(nèi)皮細胞內(nèi)檢測到前病毒DNA，感染細胞與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)時，內(nèi)皮細胞內(nèi)前病毒DNA含量，SIV P27蛋白表達量和細胞培養(yǎng)上清液中P27含量遠高于游離病毒直接感染的方式。結論 細胞介導的感染方式相較于游離病毒直接感染方式對內(nèi)皮細胞的感染能力更強，可能是SIV病毒入侵血腦屏障的主要途徑。

【關鍵詞】SIV；艾滋病腦?。粌?nèi)皮細胞；P27

艾滋病是由人類免疫缺陷病毒（HIV）感染引起的獲得性免疫缺陷綜合癥。病毒進入人體后，除攻擊CD4+T細胞造成其耗竭外還伴隨有嚴重的神經(jīng)侵襲性。HIV入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）導致的認知障礙、行為和運動缺陷稱為艾滋病相關的神經(jīng)認知紊亂（HAND）［1-4］。HIV在感染早期即可穿透血腦屏障（BBB），侵入CNS，但具體的作用機制尚不明確。目前存在幾個假說，其中比較公認的是病毒直接侵入假說、單核-巨噬細胞侵入假說、T細胞誘導假說和液相入胞假說［5］。簡單來說，即病毒以游離病毒的形式或以感染病毒的細胞為載體，藉由內(nèi)皮細胞或細胞間緊密連接處進入并感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)。迄今為止，還沒有研究對各種假說進行比較，從而闡明HIV/SIV入侵CNS的主要途徑。本研究通過比較游離病毒與T細胞介導的感染方式對SIV感染內(nèi)皮細胞的影響，以期初步驗證SIV入侵血腦屏障的主要途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

猴視網(wǎng)膜脈絡叢內(nèi)皮細胞RF/6A細胞株購自中國科學院上海生科院細胞；人急性淋巴細胞白血病T、B雜交細胞CEMx174細胞株由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所保藏；PVDF膜購自美國Millipore公司；Western blotting化學發(fā)光試劑盒購自Santa Cruz公司；BCATMProtein Assay Kit購自美國Pierce公司；蛋白預染 marker購自美國NEB公司；甲叉雙丙烯酰氨和丙烯酰胺（acrylamide）購自美國BioRad公司；β-巰基乙醇購自美國Biotech公司；辣根酶標記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋公司；DNA Blood Mini Kit購自Qiangen公司；小鼠抗SIV P27單克隆抗體由醫(yī)科院動物所制備；山羊抗小鼠FITC購自中杉金橋公司；SIV P27 ELISA試劑盒購自Life Science公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：RF/6A細胞系為貼壁細胞，生長速度較慢。在含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當細胞長到80% ～90%時，用胰酶消化進行傳代。1∶3分瓶置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。CEMx174細胞為懸浮細胞，生長速度較快。在含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當細胞濃度較大時進行1∶5傳代培養(yǎng)置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 不同方式感染RF/6A細胞：將1 mL含5× 104TCID50/mLSIVmac239病毒加到 T25瓶中感染CEMx174細胞，待CEMx174細胞出現(xiàn)細胞病變產(chǎn)生融合泡時，取細胞離心 5 min，將 1 mL 1×107TCID50/mL病毒液和1 mL 1×105個/mL感染細胞分別加入到含RF/6A細胞的6孔板，添加培養(yǎng)基使得終體積為4 mL。2 d后棄上清液和CEMx174細胞，并用無菌PBS漂洗兩遍，再加入新鮮的1640維持培養(yǎng)基，培養(yǎng)至感染后7 d，每天收集上清液，7 d收細胞備用。

1.2.3 前病毒檢測：

1.2.3.1 感染細胞DNA的提?。菏杖「腥镜膬?nèi)皮細胞5×106個，用PBS漂洗兩次后用200 μL PBS重懸。加入20 μL蛋白酶k。將200 μL樣品加入離心管中，適度混勻。參照DNA Blood Mini Kit操作步驟提取細胞中的 DNA［6］。用100 μL預熱至56℃的洗脫液洗脫樣品。取5 μL樣品用紫外分光光度計檢測提取核酸的質(zhì)量。

1.2.3.2 巢氏PCR擴增病毒gag片段［6］：使用巢式PCR的方法特異性擴增病毒gag基因，擴增片段大小為477 bp。

1.2.3.3 PCR擴增感染細胞的β-actin片段：提取感染細胞的DNA用于PCR反應，特異性擴增感染細胞的β-actin基因。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。β-actin基因的上游引物 5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下 游 引 物5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′，擴增片段長度268 bp，退火溫度61℃，每個樣品三次重復。

1.2.4 間接免疫熒光法檢測內(nèi)皮細胞內(nèi)SIVP27的表達：CEMx174感染SIVmac239發(fā)生細胞病變后離心，取500 μL 1×107TCID50/mL毒液和500 μL 1× 105個/mL的感染細胞加入含RF/6A細胞爬片的24孔板中。添加培養(yǎng)基使終體積為2 mL，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。感染2 d后，移除培養(yǎng)基并棄除CEMx174細胞。加入2 mL新鮮的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，每兩天換液1次。7 d收細胞爬片，4%多聚甲醛室溫固定20 min，吹干備用。

0.1%Triton X-100通透爬片5 min，5%FBS室溫封閉30 min，加入小鼠抗P27單克隆抗體100 μL （1∶20）37℃孵育30 min。PBS漂洗后，滴加山羊抗小鼠抗體-FITC（1∶200），37℃孵育30 min。漂洗后，DAPI封片即可在熒光鏡下觀察結果［7］。

1.2.5 Western blotting檢測RF/6A細胞中P27蛋白表達：RIPA蛋白裂解液提取不同感染方式內(nèi)皮細胞的總蛋白，BCA法測蛋白濃度。取30 μg總蛋白上樣，10%SDS-PAGE凝膠電泳，電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉的TBST封閉，選擇一抗為小鼠抗SIV P27單克隆抗體（1∶2 000），二抗為HRP-羊抗小鼠抗 體 （1∶15 000），內(nèi) 參 選 用HRP-β-actin （1∶15 000）進行ECL發(fā)光，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析。

1.2.6 ELISA試劑盒檢測上清中P27蛋白表達：將兩種感染方式不同感染天數(shù)的上清1∶100稀釋后，200 μL稀釋液加入20 μL裂解液，與板子孵育具體步驟參照ELISA檢測SIV P27盒子說明書［8］。

2 結果

2.1 巢式 PCR檢測 SIV感染內(nèi)皮細胞前病毒DNA水平

SIV感染的CEMx174細胞，做為陽性對照，PCR級水作為陰性對照。PCR產(chǎn)物電泳后，在500 bp、250 bp左右出現(xiàn)清晰條帶，與內(nèi)參β-actin（268 bp）以及前病毒DNA gag477大小相符。在內(nèi)參β-actin條帶灰度大致相當時，SIV直接感染內(nèi)皮細胞的3個復孔中只有2號泳道出現(xiàn)較淺的大小正確的目的條帶，1號泳道和3號泳道均未檢出。與SIV感染的CEMx174共培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞三個復孔均在500 bp左右出現(xiàn)目的條帶，5號泳道目的片段的亮度較6、7號泳道更強，均與陽性對照的條帶位置相同（圖1）。

2.2 間接免疫熒光法檢測SIV感染內(nèi)皮細胞中SIV P27蛋白的表達

SIV病毒直接感染內(nèi)皮細胞，其細胞核內(nèi)和胞漿內(nèi)均無綠色熒光（圖2A-C），SIV感染的CEMx174細胞與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)，內(nèi)皮細胞細胞核外、胞漿內(nèi)有明顯的點狀綠色熒光，綠色熒光蛋白的位置為病毒蛋白P27所在位置（圖2D-I）。

2.3 Western blotting檢測內(nèi)皮細胞內(nèi)SIV P27分子的表達

陽性對照為SIV感染的CEMx174細胞，陰性對照為未感染的RF/6A細胞。在1-4泳道內(nèi)參βactin蛋白條帶灰度大致相同的情況下，與感染的CEMx174共培養(yǎng)的RF/6A中，WB檢測到與目的蛋白大小相同的特異性蛋白P27的條帶，且與陽性對照條帶位置相同。而在游離SIV直接感染的內(nèi)皮細胞總蛋白中沒有檢出該目的條帶（圖3）。

注：M：DNA Marker DL2000；1-3：游離SIV病毒直接感染的內(nèi)皮細胞；4-6：與SIV感染的CEMx174細胞共培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞；8-9：ddH20作為陰性對照圖1 巢式PCR檢測SIV感染內(nèi)皮細胞前病毒DNA水平Note.M：DL 2000 DNA marker；1-3：Endothelial cells infected with SIV；4-6：Endothelial cells co-cultured with SIV-infected CEMx174 cells；7：CEMx174 cells infected with SIV as positive control；8-9：Sterile ddH2O as negative control.Fig.1 The results of nested-PCR for detecting proviral DNA levels of SIV-infected endothelial cells

2.4 ELISA方法檢測不同感染方式上清中 SIV P27含量變化情況

感染2 d時，無論是SIV直接感染還是與SIV感染的CEMx174細胞共培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)上清中P27含量基本相同，都達到20 000 pg/mL以上。2 d棄上清液和感染細胞，用PBS漂洗后兩種感染方式培養(yǎng)基殘留的病毒含量相當，但隨著感染天數(shù)的增加，與CEMx174共培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)上清液中SIV P27含量增加迅速，到感染7 d上清液中的SIV P27含量達到4 240.9 pg/mL，約為漂洗后病毒含量（1 115.6 pg/mL）的4倍，而游離SIV直接感染內(nèi)皮細胞的上清中SIV P27的含量變化不明顯，僅由漂洗后的1 064.7 pg/mL增至1 563.1pg/mL（圖4）。

3 討論

艾滋病腦病的形成與HIV/SIV病毒進入腦組織密切相關。病毒入侵BBB進入腦實質(zhì)，使腦內(nèi)細胞感染，繼而產(chǎn)生大量病毒及病毒蛋白，以及多種細胞參與釋放的細胞因子（如TNF-a等），引起神經(jīng)毒效應，最終導致艾滋病腦病的發(fā)生［9］。針對HIV/ SIV入侵血腦屏障的分子機制的假說有4種，其中游離病毒直接感染和細胞介導的感染方式最為人接受，那么在這兩者中哪個又為HIV/SIV感染內(nèi)皮細胞的最主要方式呢？

注：A-C：游離SIV病毒直接感染的內(nèi)皮細胞（×100）；D-F：與SIV感染的CEMx174細胞共培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞（×100）；G-I：與SIV感染的CEMx174細胞共培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞（×200）圖2 兩種感染方式內(nèi)皮細胞內(nèi)病毒SIV P27的檢測（標尺=100 μm）Note.A-C：Endothelial cells infected with SIV（×100）；D-F：Endothelial cells co-cultured with SIV infected CEMx174 cells（×100）；G-I：Endothelial cells co-cultured with SIV infected CEMx174 cells（×200）Fig.2 IFA showing expression of SIV P27 in SIV-infected endothelial cells

巢式PCR的結果顯示，游離病毒直接感染方式只有少量病毒能夠吸附并進入內(nèi)皮細胞內(nèi)，同時進入細胞的病毒RNA可逆轉錄為DNA整合于內(nèi)皮細胞的基因組內(nèi)。而IFA和Western blotting均不能檢出該感染方式的內(nèi)皮細胞中SIV P27蛋白，說明少量病毒雖進入了內(nèi)皮細胞但感染復制水平較低，沒有產(chǎn)生足夠多的病毒P27蛋白。這與培養(yǎng)上清中病毒SIV P27含量增長一直較低的結果一致。進一步說明游離病毒對RF/6A細胞的感染水平較低，這種低水平的感染、復制產(chǎn)生的少量病毒蛋白用WB和IFA的實驗方法檢測不到。SIV直接感染內(nèi)皮細胞的感染水平較低，主要由于內(nèi)皮細胞表面缺乏CD4受體。有一些研究顯示HIV對CD4-細胞的感染復制受限的原因是感染時進入細胞效率極低，初始感染的細胞不到1%［10，11］。這與我們發(fā)現(xiàn)的低水平感染結果一致。

既然游離SIV直接感染內(nèi)皮細胞感染能力較低，那么T細胞介導的感染方式是否能造成高水平感染呢？我們使用感染SIV的 CEMx174細胞與RF/6A共培養(yǎng)，利用巢式PCR的方法，三個復孔中均檢出內(nèi)皮細胞基因組 DNA中的前病毒分子gag477。WB和IFA結果也均顯示，內(nèi)皮細胞內(nèi)可以檢測到P27蛋白，對比游離病毒直接感染的方式，T細胞介導的感染方式可以明顯促進病毒進入并整合于內(nèi)皮細胞基因組的效率，產(chǎn)生病毒SIV P27蛋白，并大幅提高感染復制的水平。收集不同感染天數(shù)的細胞上清，ELISA的結果提示，游離病毒直接感染方式0 d和1 d上清中的病毒含量都高于細胞共培養(yǎng)的感染方式，由于病毒在CEMx174細胞中的高效復制，感染2 d時兩種感染方式的病毒含量基本相同，即總體上在游離病毒直接感染方式比T細胞介導的感染方式病毒含量高的情況下，T細胞介導的感染方式培養(yǎng)上清中病毒SIV P27蛋白顯著增加，約為初始病毒蛋白含量的四倍。然而，游離病毒直接感染的方式上清中病毒蛋白含量并沒有明顯增加。Sato H［12］等人也發(fā)現(xiàn)，細胞與細胞之間的直接接觸可以促進病毒在胞間的轉移，這種轉移導致的感染比游離病毒顆粒直接感染效率更高。

注：1：SIV感染的CEMx174細胞，作為陽性對照；2：未感染的內(nèi)皮細胞，作為陰性對照；3：游離SIV病毒直接感染的內(nèi)皮細胞；4：與SIV感染的CEMx174細胞共培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞圖3 兩種感染方式內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)SIV P27蛋白的檢測Note：1：CEMx174 cells infected with SIV as positive control；2：Uninfected endothelial cells as negative control；3：Endothelial cells infected with free SIV；4：Endothelial cells co-cultured with SIV-infected CEMx174 cells.Fig.3 Western blot analysis showing expression of SIV P27 in the endothelial cells infected by both ways

圖4 上清液中SIV P27蛋白含量的檢測Fig.4 The protein expression of SIV P27 in the supernatant of SIV-infected endothelial cells，detected by ELISA.

綜上所述，游離病毒直接感染內(nèi)皮細胞效率很低。這種低水平的感染，顯然不能帶來大面積的血腦屏障破壞，導致大量病毒和感染的淋巴細胞［13］、巨噬細胞［14］進入腦中，引發(fā)嚴重的腦部神經(jīng)病變。T細胞介導的感染方式較之對內(nèi)皮細胞的感染效率更高，感染能力更強。所以這兩種感染方式的不同結果提示我們，在艾滋病腦病形成過程中，游離病毒通過直接感染構成血腦屏障的主要成分—內(nèi)皮細胞進入腦實質(zhì)，這一現(xiàn)象雖然存在，但是進入的效率極低，并不是主要的病毒入腦途徑。血液中大量的感染細胞（單核巨噬細胞、T細胞等）與內(nèi)皮細胞接觸，可能促進內(nèi)皮細胞的感染，從而導致血腦屏障的破壞，使得大量病毒和感染細胞入腦。也就是說在艾滋病腦病的形成中，病毒入侵血腦屏障的主要方式并不是血液中游離病毒對內(nèi)皮細胞的直接感染，而是血液中感染的細胞起到了關鍵作用。也有一些研究中發(fā)現(xiàn)，感染的單核細胞或T細胞與未感染的T細胞接觸，可以通過病毒學突觸這一結構，將病毒直接轉移至未感染的T細胞內(nèi)［15-18］。但是感染T細胞與內(nèi)皮細胞的接觸，是否也能形成病毒學突觸進而促進病毒在胞間高效轉移，導致艾滋病腦病的高發(fā)病率，還沒有確鑿證據(jù)，需要進一步的研究探討。

參考文獻：

［1］ Ances BM，Ellis RJ.Dementia and neurocognitive disorders due to HIV-1 infection［J］.Semin Neurol，2007，27（1）：86-92.

［2］ Valcour V，Chalermchai T，Sailasuta N，et al.Central nervous system viral invasion and inflammation during acute HIV infection ［J］.J Infect Dis，2012，206（2）：275-282.

［3］ Mattson MP，Haughey NJ，Nath A，et al.Cell death in HIV dementia［J］.Cell Death Differ，2005，12（1）：893-904.

［4］ Anders KH，Guerra WF，Tomiyasu U，et al.The neuropathology of AIDS［J］.Am J Pathol，1986，124（3）：537-558.

［5］ 黃丹，叢喆，魏強，等.HIV/SIV入侵血腦屏障的分子機制探討［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2015，25（11）：84-88.

［6］ 叢喆，涂新明，蔣虹，等.PCR技術在猴免疫缺陷病毒SIV感染模型中的應用［J］.中國實驗動物學報，2005，13（2）：84-87.

［7］ 孫敏，涂新明，魏強，等.SIV P27單克隆抗體的制備和鑒定［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2006，16（1）：27-33.

［8］ 金光，王衛(wèi)，叢喆，等.HIV-1 P24和SIV P27兩種ELISA試劑盒檢測 SIV P27抗原的比較［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2011，21（2）：26-30.

［9］ Levy JA著，邵一鳴譯.艾滋病病毒與艾滋病的發(fā)病機制［M］.北京：科學出版社，2010：183-196.

［10］ Brack Werner R，Kleinschmidt A，Ludvigsen A.Infection of human brain cells by HIV-1：restricted virus production in chronically infected human glial cell lines［J］.AIDS，1992，6 （3）：273-285.

［11］ Mellert W，Kleinschmidt A，Schmidt J.Infection of human fibroblasts and osteoblast-like cells with HIV-1［J］.AIDS，1990，4（6）：527-535.

［12］ Sato H，Orenstein J，Dimitrov D，et al.Cell-to-cell spread of HIV-1 occurs within minutes and may not involve the participation of virus particles［J］.Virology，1992，186（2）：712-724.

［13］ Weidenheim KM，Epshteyn I，Lyman WD.Immunocytochemical identification of T-cells in HIV-1 encephalitis：implications for pathogenesis of CNS disease［J］.Mod Pathogens，1993，6（2）：167-174.

［14］ 劉克劍，叢喆，金光，等.表現(xiàn)神經(jīng)癥狀的SIVmac251感染猴大腦基底節(jié)病毒gp120序列變異分析 ［J］.中國實驗動物學報，2006，14（4）：271-275.

［15］ Hübner W，McNerney GP，Chen P，et al.Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses［J］. Science，2009，323（5922）：1743-1747.

［16］ Alvarez RA，Barría MI，Chen BK.Unique features of HIV-1 spread through T cell virological synapses［J］.PLoS Pathogens，2014，10（12）：e1004513..

［17］ Dale BM，McNerney GP，Thompson DL，et al.Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion［J］.Cell Host Microbe，2011，10（6）：551-562.

［18］ Durham ND，Yewdall AW，Chen P，et al.Neutralization resistance of virological synapse-mediated HIV-1 infection is regulated by the gp41 cytoplasmic tail［J］.Virology，2012，86 （14）：7484-7495.

〔修回日期〕2016-03-28

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）06-0001-05

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.06.001

［基金項目］國家十二五科技重大專項課題（2012ZX10004-501-001和2013ZX10004-608-003）。

［作者簡介］黃丹（1991-），女，碩士研究生，專業(yè)：比較醫(yī)學，從事實驗動物病毒學研究工作。

［通訊作者］魏強（1964-），男，研究員，博士生導師，研究方向：實驗動物病毒學。E-mail：weiqiang0430@cnilas.org。virus.Conclusions The way of T cell-mediated infection substantially enhances the capacity of SIV infection of endothelial cells than the direct infection by cell-free virus.It indicates that the T cell-mediated infection may serve as the principal route of SIV disruption of the blood-brain barrier.

Comparison of the SIV infection in endothelial cells by SIVmac239 directly or mediated by T cells

HUANG Dan，CONG Zhe，XU Pei，XUE Jing，WEI Qiang
（Comparative Medicine Center，Peking Union Medical College（PUMC）&Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences（CAMS）；Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health；Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China）

【Abstract】Objective To compare the effects of two approaches of SIVmac239 infection in endothelial cells，directly by cell-free virus or by T cell-mediated infection，to explore the predominant approach of SIVmac239 infection in endothelial cells，and finally lay a theoretical foundation of the molecular mechanism of SIV viral disruption of the bloodbrain barrier.Methods We adopted two distinct ways to infect endothelial cells.One was to directly infect the endothelial cells by cell-free virus，another was by co-culture of infected CEMx174 cells with the endothelial cells.The degree of infection in the endothelial cells was evaluated by nested-PCR，indirect immunofluorescence assay，Western blotting and ELISA assays.Results The provirus DNA was found in the endothelial cells infected in either way. However，the endothelial cells infected by co-culture with CEMx174 cells had a significantly higher amount of provirus DNA and higher expression of SIV P27 in the cells and in the supernatant than those in the ECs directly infected by cell-free

【Key words】Simian immunodeficiency virus；AIDS encephalopathy；Endothelial cells；P27