吳秋霞++孫衛(wèi)紅++王曉

摘要：采用高速逆流色譜（HSCCC）技術分離制備決明子粗提物中的蒽醌類化合物。首先用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比3 ∶ 2 ∶ 3 ∶ 2）的溶劑體系，進一步分離，從決明子粗提物中得到5種化合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和混合組分A（含有化合物Ⅱ和Ⅳ）。將組分A用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比3 ∶ 7 ∶ 5 ∶ 5）的溶劑體系進行進一步分離，得到2種化合物Ⅱ和Ⅳ。經HPLC檢測，化合物Ⅰ～Ⅶ的純度分別為99.7%、96.4%、91.0%、95.3%、98.7%、97.9%、95.8%。根據(jù)ESI-MS和1HNMR所提供的數(shù)據(jù)，化合物Ⅰ～Ⅶ分別鑒定為橙黃決明素、alaternin、1-甲氧基-2-羥基大黃素、黃決明素、1-O-甲基大黃素、決明素、大黃素。表明高速逆流色譜分離技術是一種快速有效的分離蒽醌類化合物的方法。

關鍵詞：高速逆流色譜；決明子；蒽醌類化合物

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0381-04

收稿日期：2015-05-04

基金項目：江蘇省科技支撐計劃（編號：SBE2014030578）；江蘇省博士后基金（編號：1102132C）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程。

作者簡介：吳秋霞（1987—），女，河南許昌人，碩士，研究方向為食品科學。E-mail：wqxia19890820@163.com。

通信作者：孫衛(wèi)紅，副教授，從事植物學及其抗氧化功能和營養(yǎng)品質研究。E-mail：weihongsun2009@163.com。決明子是豆科植物決明（Cassia obtusifolia L.）或小決明（Cassia tora L.）的干燥成熟種子[1]，具有清肝明目、潤腸通便、調壓降脂、增強免疫力、抗氧化和抗衰老等作用[2-4]，是一種藥食同源的中草藥植物。研究表明，決明子中的主要有效成分是蒽醌及其苷類，例如橙黃決明素、黃決明素、決明素、美決明子素和大黃素等。橙黃決明素是決明子中的一個重要蒽醌成分，對低密度脂蛋白受體基因轉錄水平有增強作用，能顯著降低高脂血癥大鼠的膽固醇、甘油三脂和低密度脂蛋白膽固醇[5]，也是決明子中控制患者血脂水平的主要有效成分[6]；決明子中的另一個蒽醌成分大黃素，具有保護肝細胞和膽管細胞、抗癌、消炎、抗血管生成和抑制蛋白質糖化及醛糖合成酶的作用[7-9]?；谝陨纤幚碜饔?，建立一種快速有效分離純化決明子中蒽醌類化合物的方法非常必要，對進一步研究闡明決明子的藥理作用非常有意義。

傳統(tǒng)的決明子中蒽醌類化合物的主要分離方法是柱色譜法[10-12]。柱色譜法的固定相一般是固態(tài)物質，會對被分離樣品中的成分產生不可逆吸附作用。而HSCCC是一種液-液分配色譜技術，其固定相是液體，不存在不可逆吸附現(xiàn)象。并且HSCCC相較于柱色譜法還具有進樣量大、成本小、操作簡單、回收率高等優(yōu)點。Yang等用6次HSCCC分離從決明子乙酸乙酯部位中分離到9種化合物[13]，分離次數(shù)多，操作繁瑣。本研究對決明子中乙酸乙酯部位進行了堿液萃取的操作，除去更多的雜質，然后再應用HSCCC技術分離決明子中的蒽醌類物質，利用2次HSCCC方法得到了7種化合物，7種化合物結構式見圖1，實現(xiàn)了快速分離。

1材料與方法

1.1原料與試劑

決明子，購自濟南市中魯醫(yī)院；用于制備決明子粗提物用的乙醇為工業(yè)乙醇，萃取和逆流色譜分離用的試劑如石油醚、乙酸乙酯、氫氧化鈉、甲醇等均為分析純；高效液相色譜用甲醇為色譜純，美國天地公司生產；水為娃哈哈純凈水。

1.2主要儀器與設備

TBP300A型高速逆流色譜儀，包括多層聚四氟乙烯螺旋管（直徑2.3 mm，分離體積300 mL，β值為0.5～0.8），上海同田生物技術有限公司生產；TBP5002泵、8823B-紫外檢測器，北京賓達英創(chuàng)科技有限公司生產；3057-11 記錄儀，重慶川儀總廠有限公司生產；Waters 600-996高效液相色譜系統(tǒng)，配有光電二極管陣列檢測器（PDA），美國Waters公司生產。

1.3試驗方法

1.3.1決明子原材料的鑒定取決明子粉末1 g，加甲醇 10 mL，浸漬1 h，過濾；濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，再加鹽酸1 mL，置水浴鍋上加熱30 min，立即冷卻，用乙醚提取2次，每次20 mL；合并乙醚液，蒸干，加三氯甲烷2 mL溶解殘渣，得到供試品溶液。取大黃素、大黃酚對照品，分別加甲醇制成每1 mL各含0.25、1.00 mg的溶液，作為對照品溶液。展開劑為石油醚（30～60 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（體積比15 ∶ 5 ∶ 1）的上層溶液，點板展開，結果見圖2。決明子樣品中與對照品有相同的Rf，結合決明子的性狀等特征，鑒定該決明子藥材是決明子（Cassia obtusifolia L.）。

1.3.2決明子粗提物的制備取決明子藥材 0.7 kg，粉碎，置于5 000 mL 圓底燒瓶中，加入10倍量95%的乙醇，加熱回流提取3次，每次2 h。抽濾后合并濾液，減壓濃縮，得稠浸膏，用水復溶。用等量的石油醚萃取3次，棄去石油醚相。再用等量乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮至800 mL，將濃縮液用5%的NaOH溶液萃取3次，萃取液用鹽酸調節(jié)pH值為2～3。再用乙酸乙酯萃取酸水液3次，將萃取液減壓

濃縮至浸膏狀，得到17.3 g決明子粗提物，置于4 ℃冰箱內用于進一步分離。

1.3.3兩相溶劑體系及樣品溶液的制備HSCCC所用的溶劑體系為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比3 ∶ 2 ∶ 3 ∶ 2和3 ∶ 7 ∶ 5 ∶ 5），按比例分別置于2 L分液漏斗中，劇烈振蕩使充分混合，于室溫下靜置分層。使用前分出上下相，超聲脫氣10 min。

HSCCC樣品溶液的制備：取決明子粗提物200 mg，加入體系為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比3 ∶ 2 ∶ 3 ∶ 2 的上下相各5 mL，超聲使其完全溶解即得。取含有成分Ⅱ和Ⅳ的混合組分A 20 mg，加入體系為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比3 ∶ 7 ∶ 5 ∶ 5） 的上下相各5 mL，超聲將其全部溶解即得。

1.3.4分配系數(shù)KD的測定溶劑系統(tǒng)的選擇是根據(jù)目標化合物的分配系數(shù)（KD）確定的，當兩相溶劑體系達到平衡后，將適量的粗樣溶解在1 mL下相中。經HPLC測定目標化合物在下相中的峰面積，記錄為A1。然后加等量的上相，完全混合均勻，平衡后經HPLC再次測定目標化合物在下相中的峰面積，記錄為A2。分配系數(shù)（KD）由下列公式確定：KD=（A1-A2）/A2。

1.3.5HSCCC的分離過程將已超聲脫氣的上相（固定相）以20 mL/min的流速泵入螺旋管中直至有上相流出，以保證固定相充滿分離螺旋管，打開主機，使色譜儀螺旋管柱按順時針方向旋轉，當轉速達到850 r/min并穩(wěn)定后，以2.0 mL/min的流速將下相（流動相）泵入分離螺旋管中，待流出的上相體積恒定（即下相流出時）平衡完畢，進樣，打開紫外檢測儀和記錄儀。檢測波長為280 nm。

1.3.6HPLC分析HPLC分析條件：色譜柱：Intersil ODS-SP （4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相：A：乙腈，B：水。梯度洗脫：0～15 min，A：40%～70%，15～25 min，A：70%，25～30 min，A：70%～100%，30～40 min，100%；流速：1 mL/min。檢測波長：285 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2結果與分析

2.1溶劑體系的選擇

溶劑體系的選擇是HSCCC分離的難點，也是最關鍵的部分。HSCCC分離的溶劑體系必須在充分混勻后快速地分層（不超過30 s）；有較高的樣品溶解量和固定相保留量；而成功的HSCCC溶劑體系還要求各目標化合物在溶劑體系中有合適的分配系數(shù)。所以溶劑體系的選擇可通過分配系數(shù)KD值的測定來確定。一般來說，KD值的最適范圍是0.5～2.0。若KD≤0.5，說明目標化合物的保留值偏低，出峰太快，各組峰之間的分離度較差。若KD≥2.0，說明目標化合物的保留值較高，雖然能夠實現(xiàn)分離，但出峰時間較長，且峰形較寬。若0.5 2.2HSCCC分離決明子粗提物

用選定的溶劑體系石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比3 ∶ 2 ∶ 3 ∶ 2），按照“1.3.4”節(jié)所述的方法對大黃蒽醌提取物進行分離純化。稱取0.2 g提取物，按照“1.3.2”節(jié)中所述的樣品溶液制備方法對樣品進行處理。根據(jù)“1.3.4”節(jié)所述的方法進行分離，結果得到化合物Ⅰ 26 mg、化合物Ⅲ 11 mg、混合組分A 20 mg（主要含化合物Ⅱ和Ⅳ）、化合物Ⅴ 23 mg、化合物Ⅵ 19 mg、化合物Ⅶ 9 mg。決明子粗提物HSCCC分離見圖3。圖中每個陰影與所標出的成分相對應，而餾分A中主要含有化合物Ⅱ和Ⅳ，有待進一步進行HSCCC分離。用選定的溶劑體系石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比3 ∶ 7 ∶ 5 ∶ 5），按照“1.3.4”節(jié)所述的方法對混合組分A進行分離純化。將20 mg混合組分A，按照“1.3.2”節(jié)中所述的樣品溶液制備方法對樣品進行處理。根據(jù)“1.3.4”節(jié)所述的方法進行分離，結果得到化合物Ⅱ9 mg和化合物Ⅳ 2 mg?；旌辖M分A的HSCCC分離見圖4。

2.3化合物的純度檢測和結構鑒定

為分析決明子粗提物中各成分的HPLC圖譜，分別測試了不同濃度和組成的流動相，包括甲醇-水、乙腈-水 、乙腈-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)以及梯度洗脫等。結果表明，流動相用乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸水溶液相似且效果最佳。本試驗選用乙腈-水體系，梯度洗脫的方法如“1.3.6”節(jié)所述。決明子粗提物和化合物Ⅰ～Ⅶ的HPLC見圖5，經測定分離得到的各組分的純度分別為99.7%、96.4%、91.0%、953%、98.7%、97.9%、95.8%。

化合物Ⅰ：ESI-MS，m/z：329[M-H]-，分子式：C17H14O7；1H-NMR（400 MHz，DMSO）：2.33（3 H，s）、3.90（3 H，s）、3.97（3 H，s）、4.90（3 H，s）、7.16（1 H，s）、7.79（1 H，s）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道結果[14-17]基本一致，確定化合物Ⅰ為橙黃決明素。

化合物Ⅱ：ESI-MS，m/z：285[M-H]-；分子式：C15H10O6；1H-NMR（400 MHz，DMSO）：3.16（3 H，s）、6.46（1 H，d，J=2.4）、7.06（1 H，d，J=2.4）、7.52（1 H，s）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道結果[14]基本一致，確定化合物Ⅱ為alaternin。

化合物Ⅲ：ESI-MS，m/z：299[M-H]-；分子式：C16H12O6；1H-NMR（400 MHz，DMSO）：2.33（3 H，s）、3.70（3 H，s）、6.56（1 H，d，J=2.4）、6.95（1 H，J=2.4）、7.76（1 H，s）、13.25（1 H，s）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道結果[11]基本一致，確定化合物Ⅲ為1-甲氧基-2-羥基大黃素。

化合物Ⅳ：ESI-MS，m/z：357[M-H]-，327[M-OCH3]-；分子式：C19H18O7；1H-NMR（400 MHz，DMSO）：2.27（3 H，s，3-CH3）、3.80、3.86、3.87、3.98（各3 H，s，1，6，7，8-OCH3）、7.50（1 H，s，H-5）、7.73（1 H，s，H-4），以上數(shù)據(jù)與文獻報道結果[16-17]基本一致，確定化合物Ⅳ為黃決明素。

化合物Ⅴ：ESI-MS，m/z：283[M-H]-；分子式：C16H12O5；1H-NMR（400 MHz，DMSO）：2.30（3 H，s）、3.82（3 H，s）、7.31（1 H，d，J=1.2）、7.63（1 H，d，J=1.2）、7.72（1 H，s）、7.8（1 H，s）、12.82（1 H，s）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道結果[15]基本一致，確定化合物Ⅴ為美決明子素。

化合物Ⅵ：ESI-MS，m/z：343[M-H]-；1H-NMR（400 MHz，DMSO）：2.27（3 H，s，3-CH3）、3.34、3.80、3.98（各3 H，s，1，6，7-OCH3）、7.31（1 H，s，H-5）、7.80（1 H，s，H-4）、13.08（1 H，s，8-OH）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道結果[16-17]基本一致，確定化合物Ⅵ為決明素。

化合物Ⅶ：ESI-MS，m/z：268.8[M-H]-；分子式：C15H10O5；1H-NMR（400 MHz，DMSO）：2.44（3 H，s）、6.56（1 H，d，J=2.4）、7.10（1 H，d，J=2.4）、7.10（1 H，s）、7.57（1 H，s）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道結果[15，18]基本一致，確定化合物Ⅶ為大黃素。

3結論

應用HSCCC分離方法，可從決明子中成功地分離出7種高純度的蒽醌類成分，其純度分別為99.7%、96.4%、91.0%、95.3%、98.7%、97.9%、95.8%。高速逆流色譜操作簡單，快速高效，重現(xiàn)性好。特別是多種溶劑體系相結合以及HSCCC和多種分離方法相結合的思路，對天然植物資源中活性成分分離純化具有很好的應用價值，也可為具活性植物特別是中草藥質量控制所需要高純度物質對照品的制備提供一種高效實用的方法。

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