楊穎　楊志崗　肖苒

應(yīng)用小室模型再生毛發(fā)的實(shí)驗(yàn)研究

楊穎楊志崗肖苒

【摘要】目的建立毛囊重建小室模型，并應(yīng)用該模型進(jìn)行毛發(fā)再生實(shí)驗(yàn)研究。方法制備小室模型，分離C57BL/6新生小鼠的表皮和真皮細(xì)胞，混合后注入小室內(nèi)。7 d后拆除小室，并觀察創(chuàng)口部位的毛發(fā)再生情況。30 d后對創(chuàng)口部位皮膚取材，行HE染色，觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果裸鼠小室植入部位創(chuàng)面愈合并可見毛發(fā)再生，新生毛發(fā)大體觀和鏡下觀與正常毛發(fā)無明顯差異，且排列極性、生長密度良好。對部分無毛發(fā)再生的創(chuàng)面進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)模型構(gòu)建過程中小室植入的位置對毛囊再生具有重要的影響。結(jié)論應(yīng)用小室模型和新生鼠表皮真皮細(xì)胞可以成功實(shí)現(xiàn)毛發(fā)再生，小室模型是一種可用于毛囊再生研究的良好動物模型，且小室的植入位置對該模型的成功與否具有重要影響。

【關(guān)鍵詞】毛發(fā)再生毛囊重建小室模型

禿發(fā)是一種常見的毛發(fā)疾病，實(shí)現(xiàn)毛發(fā)的高效再生是解決該問題的根本途徑。建立一個有效穩(wěn)定的毛發(fā)再生模型，對于闡明毛發(fā)再生機(jī)制和影響因素具有重要意義。小室模型是毛發(fā)再生研究中的常用動物模型，并具有毛發(fā)結(jié)構(gòu)、密度接近正常毛發(fā)的優(yōu)點(diǎn)[1]。本研究采用小室模型和新生鼠表皮、真皮細(xì)胞進(jìn)行毛發(fā)再生實(shí)驗(yàn)，并評估小室模型的穩(wěn)定性。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

新生C57BL/6小鼠15只 （0～2 d），5～6周齡雌性Balb/c裸鼠30只，由北京維通利華公司提供。所

1.2主要試劑

Ⅰ型膠原酶、DNaseⅠ（Sigma，美國）；中性蛋白酶（UBIO，美國）；胰酶、DMEM（Hyclone，美國）；FBS （Gibco，美國）。

1.3模型制備方法

1.3.1分離真皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞

獲取15只C57BL/6新生小鼠的皮膚，浸泡于2倍體積的0.25%中性蛋白酶中，4℃消化2 h。分別分離表皮和真皮。真皮組織用0.2%Ⅰ型膠原酶37℃消化1.5 h后再經(jīng)DNaseⅠ （終濃度為0.1 mg/mL）繼續(xù)消化30 min，消化完畢后篩網(wǎng)過濾，細(xì)胞經(jīng)離心后重懸計(jì)數(shù)。表皮組織用0.25%胰酶37℃消化10 min，經(jīng)中和后篩網(wǎng)過濾，離心并計(jì)數(shù)。1.3.2小室動物模型制備

將直徑約1 cm精油瓶內(nèi)塞（聚乙烯）倒置，中間鉆一小孔，75%乙醇消毒備用；30只裸鼠經(jīng)腹腔麻醉后，各在背部制備一直徑約1 cm的全層皮膚缺損創(chuàng)面，將小室植入，并縫合小室周邊皮膚以固定。取1×107個真皮細(xì)胞和5×106個表皮細(xì)胞，用100 μL DMEM重懸并注入小室內(nèi)。共制備30個小室模型，術(shù)后第7天將小室取出，醫(yī)用凡士林敷料覆蓋創(chuàng)面。

2　結(jié)果

2.1新生鼠表皮和真皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

獲得足夠的表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞是構(gòu)建小室模型的基本條件。通過對多個批次和不同數(shù)量的新生鼠獲得的表皮和真皮細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)新生鼠可獲取的表皮細(xì)胞數(shù)量平均為 （3.158±1.310）×106個，真皮細(xì)胞為（13.32±2.831）×106（圖1）。細(xì)胞經(jīng)接種培養(yǎng)后，第1天可見表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞均有不同程度的貼壁，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長貼壁細(xì)胞逐漸增多，真皮細(xì)胞呈長梭形，符合典型成纖維樣細(xì)胞特點(diǎn)，表皮細(xì)胞呈典型鋪路石樣，符合典型上皮樣細(xì)胞特點(diǎn)（圖1）。

圖1　新生鼠表皮和真皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)Fig.1　Isolation and culture of epidermal and dermal cells from newborn mice

2.2小室模型的建立及毛發(fā)再生的觀察

術(shù)后7 d拆除小室，見創(chuàng)面邊緣有紅色肉芽組織，表面偶可見膜狀細(xì)胞聚集物（圖2）。術(shù)后10～12 d皮膚創(chuàng)面基本愈合，與正常部位皮膚相比顏色較深。術(shù)后16～20 d，多數(shù)裸鼠愈合創(chuàng)面有毛發(fā)突出體表，隨著時(shí)間的延長，可見毛發(fā)數(shù)量和長度明顯增加，且極性好、排列整齊；部分裸鼠愈合創(chuàng)面可見瘢痕形成，與正常皮膚顏色接近或部分皮膚顏色變深，但均無毛發(fā)長出（圖3）。實(shí)驗(yàn)過程中我們發(fā)現(xiàn)，小室植入位置如靠近尾部，其在生長過程中容易被裸鼠啃咬，創(chuàng)面雖能愈合但無毛發(fā)再生；相反，靠近頭部位置植入的小室則很難被裸鼠咬到，創(chuàng)口部位一般均有毛發(fā)再生，再生毛發(fā)致密（圖3）。

圖2　小室的植入和拆除Fig.2　The implantation and removal of chamber

圖3　應(yīng)用小室模型毛發(fā)再生情況和小室植入位置對毛發(fā)再生的影響Fig.3　Hair regeneration by chamber assay and the effect of chamber implantation sites on the regeneration of hair

圖4　小室模型建立后的皮膚組織學(xué)觀察Fig.4　Histological observation of regenerated skin by chamber assay

2.3創(chuàng)面愈合后皮膚的組織形態(tài)學(xué)觀察

伴有毛發(fā)再生的創(chuàng)面皮膚經(jīng)HE染色后，鏡下可觀察到結(jié)構(gòu)完整的毛囊，可見完整的毛干；對于無毛發(fā)再生的愈合創(chuàng)面，鏡下可見皮膚組織中毛囊結(jié)構(gòu)稀少，平行于表皮的大量膠原纖維束形成瘢痕組織（圖4）。

3　討論

小室模型采用雙層硅膠小室，先將下層小室植入裸鼠背部，然后將表皮和真皮細(xì)胞混合后注入小室中，而后再蓋上上層小室以保護(hù)添加至創(chuàng)面上的表皮和真皮細(xì)胞[2-3]；2008年，Lichti等[4]對該模型進(jìn)行了改進(jìn)，進(jìn)一步簡化了小室的結(jié)構(gòu)。相較于皮下注射法和皮瓣法等毛發(fā)再生模型，小室模型再生的毛發(fā)在質(zhì)量、密度以及組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)上與正常毛發(fā)更為接近[1，5]。本實(shí)驗(yàn)中，我們采用聚乙烯瓶內(nèi)塞作為小室，成功地構(gòu)建了該模型并實(shí)現(xiàn)了毛發(fā)的再生，進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型的可靠性。

我們在模型制備過程中發(fā)現(xiàn)，小室植入位置對動物模型成功率和穩(wěn)定性具有重要影響。小室植入部位如靠近尾部，創(chuàng)面愈合后基本無毛發(fā)再生；而靠近頭部位置植入的小室，伴隨著創(chuàng)口的愈合，毛發(fā)的數(shù)量和長度明顯增加。我們觀察發(fā)現(xiàn)，近尾部植入的小室容易在植入第2天被裸鼠啃咬，使得細(xì)胞暴露于空氣中，喪失了小室的保護(hù)作用，植入細(xì)胞的活性可能因此受到不同程度的影響。從而出現(xiàn)了不同的創(chuàng)面愈合情況，如有的創(chuàng)面基本無植入細(xì)胞參與，愈合后皮膚色澤與裸鼠其他部位皮膚無異；有的創(chuàng)面愈合后則有明顯的黑色素沉著，與毛發(fā)再生部位皮膚相類似?？拷^部植入的小室創(chuàng)面愈合后均有毛發(fā)再生，其主要原因在于該部位小室無破損現(xiàn)象發(fā)生，更好地保護(hù)了植入的細(xì)胞，并且在拆除小室時(shí)可觀察到膜樣的新生組織。之前的報(bào)道對小室植入位置的研究較少，有學(xué)者為了保護(hù)植入的小室，曾應(yīng)用金屬線網(wǎng)覆蓋在小室表面以免小室被裸鼠啃咬[6]。我們通過改變植入位置即可達(dá)到保護(hù)小室的目的，進(jìn)一步簡化了該模型的制備流程并提高了成功率。

毛囊再生是表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞相互作用的結(jié)果，不同的研究在毛囊再生小室模型構(gòu)建中采用了不同來源的真皮和表皮細(xì)胞。其中，真皮細(xì)胞主要包括胎鼠[6]和新生鼠[2，7-8]來源的真皮細(xì)胞、成鼠毛乳頭細(xì)胞[8-13]、成纖維細(xì)胞[13]等，表皮細(xì)胞包括胎鼠[6]和新生鼠[9-12]來源的表皮細(xì)胞，以及成鼠外根鞘細(xì)胞[13]等。研究表明，胎鼠和新生鼠真皮細(xì)胞、成鼠毛乳頭細(xì)胞與表皮細(xì)胞混合后均可使毛發(fā)再生，這些細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后毛發(fā)再生能力減弱，而成纖維細(xì)胞則不具備毛發(fā)再生能力[2，8]。我們應(yīng)用新鮮分離的新生鼠真皮和表皮細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了毛發(fā)的再生，與之前文獻(xiàn)研究結(jié)果一致。新生鼠真皮和表皮細(xì)胞均為異質(zhì)性細(xì)胞群體，真皮細(xì)胞中包含了毛乳頭細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，表皮細(xì)胞則包含了不同發(fā)育階段的表皮細(xì)胞以及毛囊源性表皮細(xì)胞[2，8]。小室模型為細(xì)胞的毛囊再生能力研究提供了一個非常好的模型，借助該模型對新生鼠真皮和表皮細(xì)胞中不同類型的細(xì)胞群體進(jìn)行更為深入的研究，有利于進(jìn)一步闡明毛發(fā)再生的機(jī)制。

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【中圖分類號】Q813.1+2

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1673－0364（2016）03－0160－03

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.03.004

作者單位：100144北京市中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院研究中心。

通訊作者：楊志崗（E-mail：yzg365cn@163.com）。有實(shí)驗(yàn)動物均為SPF級，層流室內(nèi)飼養(yǎng)。

收稿日期：（2016年3月12日；修回日期：2016年3月28日）

The Research of Hair Regeneration by Chamber AssayYANG Ying,YANG Zhigang,XIAO Ran.Research Center, Plastic Surgery Hospital,CAMS,Beijing 100144,China.Corresponding author:YANG Zhigang(E-mail:yzg365cn@163.com). 【Abstract】ObjectiveTo establish a hair reconstitution chamber model for experimental study of hair regeneration. MethodsEpidermal and dermal cells from newborn C57BL/6 mice were isolated,mixed and injected into the chambers.7 days after the removal of the chambers,hair regeneration at the wound site was continually observed.At 30 days,the skin of wound sites was obtained and HE staining was performed to observe the morphological structures.ResultsWound healing and hair regeneration were observed at chamber implantation site,the regenerated hair had no significant difference from normal skin,with well-maintained polarity and density.By analyzing the wound sites without hair regeneration,we found that chamber implantation sites have great influence on hair regeneration.ConclusionNewborn epidermal and dermal cells can successfully regenerate hair by chamber assay,chamber assay is a good animal model for hair regeneration,and chamber implantation sites play an important role in the success foundation of chamber model.

【Key words】Hair regeneration;Hair follicle reconstitution;Chamber model