張變莉++王楊++劉榮寧++范國(guó)強(qiáng)

摘要：將臺(tái)灣泡桐葉片愈傷組織放置于含有不同質(zhì)量濃度秋水仙素的液體培養(yǎng)基上進(jìn)行四倍體植株的誘導(dǎo)，采用根尖細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)和葉片單細(xì)胞DNA含量測(cè)定的方法進(jìn)行倍性分析。結(jié)果表明，在27個(gè)試驗(yàn)組合中，用 30 mg/L秋水仙素處理預(yù)培養(yǎng)6 d的臺(tái)灣泡桐葉片48 h時(shí)，四倍體誘導(dǎo)率最高，為5.83%。根尖染色體壓片結(jié)果也表明，臺(tái)灣泡桐二倍體染色體數(shù)為2n=2x=40，四倍體為2n=4x=80。此外，與二倍體相比，誘變出的四倍體植株，具有生長(zhǎng)慢、莖加粗、葉片增寬、單個(gè)氣孔面積增大、氣孔密度減少等特征。

關(guān)鍵詞：臺(tái)灣泡桐；葉片；秋水仙素；四倍體

中圖分類號(hào)： S792. 430.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0290-04

收稿日期：2016-04-21

基金項(xiàng)目：河南省杰出人才創(chuàng)新基金（編號(hào)：321001700）；河南省高校杰出科研人才工程基金（編號(hào)：2002KYC-003）；河南省鄭州市普通科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：153PKJGG423）。

作者簡(jiǎn)介：張變莉（1982—），女，河南通許人，碩士，講師，主要從事園林綠化及林木生物技術(shù)的教學(xué)和科研工作。E-mail：kfzbl@163.com。

通信作者：范國(guó)強(qiáng)，博士，教授，主要從事泡桐豐產(chǎn)栽培理論與生物技術(shù)研究。E-mail：gqfan@ henau.edu.cn。植物多倍體具有抗逆性和適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，能滿足生產(chǎn)上高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲(chóng)害等要求，而且作為遺傳橋梁，對(duì)開(kāi)展目的基因漸滲和轉(zhuǎn)移研究具有重要意義。目前，人工誘導(dǎo)植物多倍體已在楊樹(shù)、桑樹(shù)等林木樹(shù)種[ 1-12]上取得突破。泡桐在我國(guó)有著悠久的栽培歷史，由于其生長(zhǎng)快、用途廣，廣受栽培者的歡迎。然而，泡桐叢枝病的頻發(fā)及“久治不愈”嚴(yán)重影響了其大面積栽植和應(yīng)用。近年來(lái)，范國(guó)強(qiáng)等[13-18]成功誘導(dǎo)了同源四倍體蘭考、白花、南方、豫雜一號(hào)等植株，但目前有關(guān)臺(tái)灣泡桐四倍體誘導(dǎo)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以臺(tái)灣泡桐組培苗葉片為材料，采用不同質(zhì)量濃度秋水仙素對(duì)其進(jìn)行了同源四倍體誘導(dǎo)，為豐富泡桐四倍體種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用材料為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)試驗(yàn)站的臺(tái)灣泡桐種子，采集后，先用70%乙醇消毒30 s，再用0.1% HgCl2 消毒 5 min，取出后，無(wú)菌水沖洗3～5次，之后將種子晾干，置于裝有40 mL MS 培養(yǎng)基 （ 含3.0 g/L瓊脂粉、25 g/L蔗糖） 的三角瓶中，在培養(yǎng)箱 [溫度（25±2） ℃，光照時(shí)間為 16 h/d，光照度為130 μmol/（m2·s）]內(nèi)培養(yǎng)。將生長(zhǎng) 80 d 的同一株臺(tái)灣泡桐組培苗上部2片完全展開(kāi)葉片置于其器官直接發(fā)生的培養(yǎng)基[19]上增殖后，取其葉片待用。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1臺(tái)灣泡桐葉片的預(yù)培養(yǎng)取臺(tái)灣泡桐組培苗自頂部向下數(shù)的第 2～4 對(duì)葉片，剪成1.0 cm×1.0 cm小塊，分別置于裝有40 mL的MS+0.1 mg/L NAA+16.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基[19] 的三角瓶中，在20 ℃的黑暗條件下進(jìn)行不同時(shí)間（表1）的預(yù)培養(yǎng)。

1.2.2秋水仙素誘導(dǎo)臺(tái)灣泡桐四倍體植株將上述預(yù)培養(yǎng)不同時(shí)間的外植體（臺(tái)灣泡桐葉塊）分別接種于含有秋水仙素液體培養(yǎng)基[19]的三角瓶中，并按照設(shè)計(jì)組合（表1）置于 20 ℃ 的黑暗條件下進(jìn)行四倍體誘導(dǎo)。 誘導(dǎo)結(jié)束后，無(wú)菌水沖洗葉片3～5次，再將葉片表面水分用無(wú)菌濾紙吸干，之后轉(zhuǎn)入不含秋水仙素的MS+0.1 mg/L NAA+16.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上，于光照度為130 μmol/（m2·s） 、光照時(shí)間為 16 h/d、溫度為25 ℃的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行芽誘導(dǎo)，每處理30瓶，每瓶2個(gè)葉塊。15 d后，統(tǒng)計(jì)臺(tái)灣泡桐外植體存活數(shù)，30 d后統(tǒng)計(jì)外植體出芽數(shù)，并計(jì)算其存活率[（存活的外植體個(gè)數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%]和芽誘導(dǎo)率[（誘導(dǎo)出芽外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%]。 將誘導(dǎo)后長(zhǎng)至2 cm的幼芽剪下，接種于1/2 MS 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，每30 d 繼代培養(yǎng)1次，共繼代5次。

第5次繼代苗培養(yǎng)后，幼芽根長(zhǎng)至1.5～2.0 cm時(shí)，先剪其根尖制成壓片[20]用于觀察染色體的加倍情況，再用流式細(xì)胞儀[21]確認(rèn)秋水仙素誘變的臺(tái)灣泡桐幼苗的倍性，并計(jì)算其四倍體誘導(dǎo)率（ 流式細(xì)胞儀檢測(cè)四倍體幼芽數(shù)/外植體誘導(dǎo)出的總芽數(shù)） 。 每組試驗(yàn)重復(fù)2次，數(shù)據(jù)采用 SPSS 軟件處理，并進(jìn)行F檢驗(yàn)。

1.2.3臺(tái)灣泡桐四倍體植株的鑒定（1）幼苗根尖染色體計(jì)數(shù)。臺(tái)灣泡桐二倍體幼苗及秋水仙素誘導(dǎo)變異幼苗的根尖細(xì)胞染色體觀察參照舒壽蘭等[ 20]的方法。在尼康TS-100熒光倒置顯微鏡（2 000×）下，觀察上述根尖臨時(shí)壓片中的染色體條數(shù)并拍照。（2）葉片單細(xì)胞DNA相對(duì)含量測(cè)定。分別將染色體加倍的及普通二倍體的臺(tái)灣泡桐葉片各50 mg置于2 mL緩沖液Ⅰ（0.5%T ween 和濃度為0.1 mol/L的檸檬酸） 中，然后用剪刀或鋒利的刀片將其切碎，用300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾至BD專用試管中，重復(fù)過(guò)濾2次去除雜質(zhì)。留取1 mL濾液置于轉(zhuǎn)速為1 500 r/min的離心機(jī)中4 ℃離心5 min，棄除上清液，并加入1 mL鞘液輕微搖勻，然后再置入上述轉(zhuǎn)速離心機(jī)中4 ℃離心5 min。倒掉上清液，在沉淀中加入 0.5 mL 儀器所帶熒光染色液，輕微振蕩搖勻后避光放置 30 min，以便充分染色。然后用300目濾網(wǎng)過(guò)濾1次至試管中，用于測(cè)定葉片單細(xì)胞DNA相對(duì)含量。

1.2.4植株形態(tài)特征比較觀察并記錄上面生長(zhǎng)30 d第5次繼代的四倍體和二倍體臺(tái)灣泡桐幼苗葉形、葉色等差異。每一指標(biāo)測(cè)定10個(gè)樣品，求其平均值。

1.2.5表皮細(xì)胞氣孔器的比較取苗齡60 d的四倍體和二倍體臺(tái)灣泡桐組培苗成熟葉片，放置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% 的KOH溶液中煮沸3～5 min，然后置于冷水中。先在載玻片上滴一滴清水，再用鑷子挑取其表皮并展平放于載玻片的水滴上，用濾紙吸去過(guò)多的水分。然后蓋上蓋玻片并用目鏡中帶有測(cè)微尺鏡頭的顯微鏡觀察，在100×10的油鏡下觀察測(cè)量每個(gè)氣孔器的長(zhǎng)度、寬度和氣孔器個(gè)數(shù)，計(jì)算氣孔器密度，3次重復(fù)，取平均值。