魏敬懷++周燚+余思策+向蘭香+杜曉英

摘要：以魔芋軟腐病菌（Ervinia carotovora pv.carotovora）、白菜黑腐病菌[Xanthomonas campestris pv.campestris （Pam） Dowson]、甜瓜細(xì)菌性果斑病菌（Acidovorax avenae citrulli）為供試菌，采用瓊脂藥劑擴(kuò)散法對(duì)26種植物進(jìn)行抑菌活性篩選。結(jié)果表明，銅錢細(xì)辛、裸蕓香和小勾兒茶的甲醇提取物在20 mg/mL時(shí)對(duì)3種病原細(xì)菌均有抑制活性。其中，裸蕓香的抑制活性最好，抑菌圈平均直徑分別達(dá)1.712、1.611、1.889 cm；銅錢細(xì)辛的抑菌圈平均直徑分別為0962、0.874、1.011 cm；小勾兒茶的抑菌圈平均直徑分別為0.671、0.753、0.724 cm。裸蕓香石油醚層萃取部在 5 mg/mL 時(shí)對(duì)魔芋軟腐病菌的抑菌活性最好，抑菌圈的平均直徑達(dá)1.487 cm，是下一步研究的重點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：植物源農(nóng)藥；甲醇提取物；植物病原細(xì)菌；抑菌活性

中圖分類號(hào)： S482.2+92文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0233-03

收稿日期：2016-03-23

基金項(xiàng)目：湖北省自然科學(xué)基金（編號(hào)：2015CFA107）。

作者簡(jiǎn)介：魏敬懷（1990—），男，安徽淮南人，碩士研究生，從事新農(nóng)藥開發(fā)的研究。E-mail：weijinghuaizmm@163.com。

通信作者：杜曉英，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事農(nóng)藥學(xué)的教學(xué)與研究工作。E-mail：cjdxdxy@163.com。作物細(xì)菌性病害是世界性常發(fā)流行性病害，細(xì)菌性病害的危害程度比真菌性病害更加嚴(yán)重和更加難以防治[1]。隨著蔬菜栽培連作年限的增加，病害發(fā)生逐漸加重[2]。魔芋軟腐病主要是由胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌（Erwinia bacterium）和菊歐文氏桿菌（Erwinia chrysanthemi）引起的細(xì)菌性病害[3]，在魔芋生長(zhǎng)和貯藏期均可危害。生長(zhǎng)期發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可造成魔芋成片倒苗，發(fā)病嚴(yán)重地塊一般連作3年后魔芋基本無收成[4]。白菜黑腐病由野油菜黃單胞桿菌（Xanthomonas campestris）引起，是一種世界性十字花科蔬菜重要病害[5]，嚴(yán)重影響白菜的產(chǎn)量和冬貯供應(yīng)[6]。甜瓜細(xì)菌性果斑病又稱細(xì)菌性果腐病，其病原菌為嗜酸菌屬西瓜種（Acidovorax citrulli）[7]，是近年由國(guó)外傳入我國(guó)的一種毀滅性病害[8]。目前針對(duì)以上3種病害主要依靠抗病育種和化學(xué)藥劑防治?？共∮N操作困難且周期較長(zhǎng)，化學(xué)藥劑防治不但污染環(huán)境，而且長(zhǎng)期大量使用化學(xué)藥劑易使細(xì)菌產(chǎn)生抗性，從而大大降低防治效果。自然界中，植物與病原物長(zhǎng)期斗爭(zhēng)，此消彼長(zhǎng)，結(jié)果形成了某些植物獨(dú)特的抑菌能力。因此研究植物天然物質(zhì)，尋找結(jié)構(gòu)新穎，作用機(jī)理特殊的抑菌活性化合物，是殺菌劑研究與開發(fā)的一條重要途徑。目前關(guān)于植物抑菌成分的研究很多，科研人員發(fā)現(xiàn)菊科、唇形科、木蘭科、馬兜鈴科、蓼科、木樨科、百合科、葫蘆科、莎草科、豆科、十字花科、樟科等的某些植物中均含有天然殺菌成分[9-10]。本研究采集了26種植物，分別測(cè)定其對(duì)3種病原菌的抗菌活性，以期篩選到抑菌活性較好的植物，為下一步分離和純化活性化合物提供材料，同時(shí)為進(jìn)一步開發(fā)利用和保護(hù)植物資源提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試植物材料

植物材料見表1，由武漢植物園江明喜研究員鑒定。

1.2供試細(xì)菌

魔芋軟腐病病原菌（Ervinia carotovora pv.carotovora）、白菜黑腐病病原菌[Xanthomonas campestris pv.campestris （Pam） Dowson]、甜瓜細(xì)菌性果斑病病原菌（Acidovorax avenae citrulli），以上3種病原細(xì)菌由長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院植病課題組提供，周燚教授鑒定。

1.3培養(yǎng)基及其成分

培養(yǎng)基參照并改進(jìn)袁尚勇的方法[11]制得。每1 L培養(yǎng)基含牛肉浸膏3 g、蛋白胨10 g、蔗糖10 g、瓊脂12 g，培養(yǎng)基pH值調(diào)至7.0。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1植物甲醇提取物對(duì)3種植物病原菌的抑菌活性測(cè)定方法植物有效成分的提取參照陳興龍等的方法[12]并加以改進(jìn)，將采集的植物材料陰干，再置于50 ℃電熱鼓風(fēng)箱烘干，粉碎，用5倍植物材料體積的甲醇分別避光浸提3、2、1 d，合并浸提液，過濾濃縮得植物粗提物，密封置于4 ℃冰箱備用。抑菌活性測(cè)定采用瓊脂藥劑擴(kuò)散法[13]。具體操作如下：稱取1 g植物甲醇提取物，用5 mL丙酮溶解，配成濃度為200 mg/mL的提取物母液。取0.5 mL母液用無菌水定容至5 mL，配制成濃度為20 mg/mL的藥液備用。病原菌于斜面培養(yǎng)基上 30 ℃ 培養(yǎng)2 d，加入無菌水，刮下菌苔，與無菌水充分混合，用比較儀對(duì)照制成含細(xì)菌濃度為6×109～6×1010 CFU/L的細(xì)菌懸浮液。取200 μL細(xì)菌懸浮液加入到定量30 mL熔融冷卻至50 ℃左右的培養(yǎng)基中，充分搖勻并用9 cm培養(yǎng)皿倒平板，用直徑0.5 cm滅菌打孔器于平板上打孔，并向孔中加入1滴瓊脂，每皿3孔，2個(gè)孔為藥劑處理，均加入50 μL藥液，1個(gè)孔為空白對(duì)照，加入50 μL 10%丙酮溶液。重復(fù)3次。將各處理于30 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察孔穴周圍有無抑菌圈，如有用十字交叉法測(cè)量各抑菌圈的直徑，去除孔穴直徑0.5 cm，取其平均值。

1.4.2裸蕓香萃取物對(duì)魔芋軟腐病原菌的抑制活性測(cè)定采取液-液萃取法。分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯與裸蕓香提取物的水溶物進(jìn)行等量液-液萃取，每萃取重復(fù)3次，合并濃縮各萃取層得到各層萃取部，密封后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。萃取部抗菌活性測(cè)定方法同“1.4.1”節(jié)，植物萃取物藥液濃度為5 mg/mL。

2結(jié)果與分析

2.126種植物甲醇提取物對(duì)3種病原細(xì)菌的抑菌活性初篩

采取瓊脂藥劑擴(kuò)散法測(cè)定26種植物甲醇提取物對(duì)3種病原細(xì)菌的抑制活性，結(jié)果見表2。由表2可知，在供試的26種植物中，銅錢細(xì)辛、小勾兒茶和裸蕓香的甲醇提取物在濃度為20 mg/mL時(shí)對(duì)3種植物病原細(xì)菌均有抑制活性。其中裸蕓香甲醇提取物對(duì)魔芋軟腐病菌、白菜黑腐病菌和甜瓜細(xì)菌性果斑病菌的抑菌圈直徑最大，抑菌圈平均直徑分別為1712、1.611、1.889 cm；銅錢細(xì)辛甲醇提取物對(duì)魔芋軟腐病菌、白菜黑腐病菌和甜瓜細(xì)菌性果斑病菌的抑菌圈直徑次之，抑菌圈平均直徑分別為0.962、0.874、1.011 cm；小勾兒茶甲醇提取物對(duì)魔芋軟腐病菌、白菜黑腐病菌和甜瓜細(xì)菌性果斑病菌的抑菌圈直徑最小，抑菌圈平均直徑僅分別為0.671、0753、0.724 cm。其余供試的23種植物甲醇提取物在濃度為20 mg/mL時(shí)對(duì)3種植物病原細(xì)菌的平均抑菌圈直徑均為0，均無抑菌活性。

2.2裸蕓香甲醇提取物各萃取部對(duì)魔芋軟腐病菌的抑菌活性

采取瓊脂藥劑擴(kuò)散法測(cè)定裸蕓香甲醇提取物的各溶劑萃

取部對(duì)3種病原細(xì)菌的抑制活性，結(jié)果見表3。由表3可知，裸蕓香甲醇提取物的各有機(jī)溶劑萃取部在濃度為5 mg/mL時(shí)對(duì)魔芋軟腐病菌均有抑制作用，其中石油醚萃取部抑菌圈的平均直徑最大，達(dá)1.487 cm；乙酸乙酯萃取部的抑菌圈平均直徑最小，僅為1.159 cm。裸蕓香甲醇提取物水部濃縮物濃度為5 mg/mL時(shí)對(duì)魔芋軟腐病菌抑菌圈直徑為0，無抑菌效果。

3討論

本研究測(cè)定的26種植物甲醇提取物中，大部分對(duì)供試的3種病原細(xì)菌無抑制活性，相同的植物提取物對(duì)不同的病原細(xì)菌的抑制活性也有差別。在對(duì)供試3種病原細(xì)菌均有抑制活性的3種植物中，在濃度為20 mg/mL時(shí)，裸蕓香甲醇提取物的抑菌活性最好，銅錢細(xì)辛次之，小勾兒茶最差。由于不同病原菌對(duì)相同物質(zhì)的敏感度并不相同，對(duì)供試病原菌無活性的這23種植物也可能對(duì)其他病原細(xì)菌或真菌有抑制活性，本研究并未涉及，所以可以進(jìn)一步研究這些植物對(duì)其他病原菌的抑制活性，以便發(fā)現(xiàn)更多的殺菌植物，以豐富植物性殺菌劑的研究?jī)?nèi)容，為植物性殺菌劑的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。采取液-液萃取法跟蹤分離裸蕓香甲醇提取物對(duì)魔芋軟腐病病原菌的抑菌活性發(fā)現(xiàn)，在濃度為5 mg/mL裸蕓香甲醇提取物的石油醚層萃取部對(duì)魔芋軟腐病病原菌的抑制活性最好，可采取色譜技術(shù)對(duì)裸蕓香甲醇提取物的石油醚層萃取部進(jìn)一步分離，以期分離出具有抑菌活性的單體，為新農(nóng)藥的研究與開發(fā)提供結(jié)構(gòu)新穎的先導(dǎo)化合物。

參考文獻(xiàn)：

[1]胡重怡，蔡劉體. 噬菌體治療作物細(xì)菌性病害的研究進(jìn)展[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（3）：101-103.

[2]李寶聚. 我國(guó)蔬菜病害研究現(xiàn)狀與展望[J]. 中國(guó)蔬菜，2006（1）：1-5.

[3]吳金平. 魔芋軟腐病病原菌及其拮抗菌的研究[D]. 武漢：武漢大學(xué)，2010.

[4]魯紅學(xué)，周燚，趙明敏，等. 不同藥劑對(duì)魔芋軟腐病的防治效果[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2007（4）：44-45.

[5]Williams P H. Black rot：a continuing threat to world crucifers[J]. Plant Disease，1980，64（8）：736-742.

[6]李省印. 西安地區(qū)大白菜主要病害發(fā)生原因調(diào)查[J]. 北方園藝，1989（9）：29-32.

[7]閻莎莎，王鐵霖，趙廷昌. 瓜類細(xì)菌性果斑病研究進(jìn)展[J]. 植物檢疫，2011，25（3）：71-76.

[8]王雪，高潔，張靜，等. 63種殺菌劑對(duì)西瓜、甜瓜細(xì)菌性果斑病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34（6）：612-617，623.

[9]王發(fā)松，楊得波，任三香，等. 香葉樹果揮發(fā)油的化學(xué)成分和抗菌活性研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2000，11（6）：14.

[10]于文喜，康迎昆，靳春波，等. 暴馬丁香心材提取物中有效抗菌成分的研究[J]. 林業(yè)科技，1996，21（6）：23-25.

[11]袁尚勇. 魔芋軟腐菌生物學(xué)特性測(cè)定及軟腐病防治方法研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[12]陳興龍，潘汝謙，蓋云鵬，等. 31種植物甲醇提取物對(duì)荔枝霜疫霉菌和炭疽病菌的抑菌活性測(cè)定[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，39（3）：1-3.

[13]周立剛. 植物抗菌化合物[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2005：74-83.