張清霞++王英+李曦+劉正坪++唐文華+童蘊慧

摘要：利用煙草-花葉病病害體系檢測苯并噻唑硫代乙酸甲酯（benzothiadiazoles，BTH）、金針菇（Flammulina velutipes）發(fā)酵液提取物（JZG）誘導抗病作用。試驗用盆栽珊西煙（Nicotiana tobacum，Xanthi-nc）為材料，用誘導劑處理煙草第6片葉，然后在上部未處理葉接種煙草花葉病毒（TMV），結(jié)果發(fā)現(xiàn)上部葉片產(chǎn)生的TMV枯斑數(shù)與對照相比顯著減少，說明這2種誘導劑能誘導煙草植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性。同時研究了BTH、JZG作為誘導劑處理煙草后寄主內(nèi)幾種抗病相關(guān)酶的變化，結(jié)果表明煙草葉片組織中的幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶活性增加，且酶活性可在處理后15 d內(nèi)維持高于對照組的水平。

關(guān)鍵詞：幾丁質(zhì)酶；β-1，3-葡聚糖酶；煙草；金針菇；病程相關(guān)蛋白

中圖分類號： S435.72文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0220-02

收稿日期：2015-05-11

基金項目：國家自然科學基金（編號：31000875）；揚州大學生科技創(chuàng)新基金資助。

作者簡介：張清霞（1976—），女，博士，副教授，主要從事植物病害生物防治。E-mail：zqx817@sohu.com。

通信作者：唐文華，博士，教授，主要從事土傳病害生物防治研究。E-mail：wenhuatang@sina.com。誘導抗性是指植物受到適當刺激后獲得的對隨后病原菌侵染的抵抗能力[1]。許多植物上誘導的防衛(wèi)反應不僅在植物的初侵染部位增強，而且在未受侵染、空間上隔離的部位也增強，這種誘導抗性又稱為系統(tǒng)性獲得抗性（systemic acquired resistance，SAR）。病原菌誘導的SAR一個顯著特征就是寄主植物水楊酸（ssalicylic acid，SA）合成的增加。SA是SAR信號傳導中的重要因子。SAR的另一個特征是所謂的SAR基因的激活，包括編碼病程相關(guān)蛋白的基因[2]，它們通常被用作誘導抗性的標記。人們通過系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，不但真菌、細菌和病毒能誘導植物產(chǎn)生抗病性[2-3]，而且一些體外無殺菌作用的化學物質(zhì)，如水楊酸（SA）、2，6-二氯異煙酸（INA）、苯并噻唑硫代乙酸甲酯（benzothiadiazole，BTH）[4]等也具有這種能力。

植物誘導抗病性具有抗病譜廣、持續(xù)時間長、系統(tǒng)性等優(yōu)點，而且大部分的誘導劑對環(huán)境無污染[5]。這些特點說明植物誘導抗病性在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有良好的應用前景。BTH就是這樣一個理想的誘導劑，它不僅能誘導植物抵抗苗期病害，而且對植物采后病害也有良好的防治效果[6]。但是BTH目前只在歐洲市場實現(xiàn)了商品化，在我國尚未注冊應用。本項工作作為尋找新型誘抗劑的初步研究，利用煙草系統(tǒng)來檢測金針菇發(fā)酵液是否具有誘導寄主抗病性的功能，以及經(jīng)該液體處理后寄主體內(nèi)抗病相關(guān)蛋白的變化。

1材料與方法

1.1植物材料

煙草品種：珊西煙（Nicotiana tobacum，Xanthi-nc），溫室中自然光照生長，植株第13片真葉完全展開時用于試驗。

1.2供試抗性誘導劑

JZG（金針菇發(fā)酵液提取物），金針菇菌株接入馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，放置振蕩搖床（130 r/min）培養(yǎng)12 d（28 ℃），紗布過濾，濾液用乙酸乙酯以1 ∶ 1比例抽提，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，以甲醇溶解濃縮物（濃縮1 000倍），使用時兌蒸餾水稀釋1 000倍；BTH（benzothiadiazoles），諾華農(nóng)化有限公司生產(chǎn)，使用濃度為75 μg/mL。

1.3供試毒源與濃度

TMV毒源由中國農(nóng)業(yè)大學植病系病毒室提供，取1 g病葉加10 mL磷酸緩沖液（pH值 6.8）研磨成勻漿，紗布過濾，磨擦接種普通煙，發(fā)病后病葉用作TMV毒源。

1.4處理時間與方法

取長勢均一的珊西煙（13葉期），各種誘導劑或清水以涂抹方式處理煙草的第6片葉，以濕潤為準。清水處理為對照。每個處理3次重復，每個重復3株。處理6 d后，在上部未用誘導劑處理的第7、8、9片葉片表面采用摩擦接種法接種TMV。

1.5調(diào)查時間

TMV枯斑充分表現(xiàn)（接種TMV后2～3 d，25 ℃），統(tǒng)計各處理不同葉位的枯斑數(shù)目。

1.6取樣方法

分別在誘導劑處理珊西煙后1、6、9、15、20、25 d，取上部未處理的第7、8、9葉為樣本，液氮速凍，放入-80 ℃冰箱保存待用。

1.7酶活性的測定

將各處理珊西煙葉片在液氮中研磨，按1 g ∶ 2 mL的比例用0.1 mol/L的檸檬酸鈉緩沖液（pH值為5.0）制成勻漿，15 000 r/min 離心15 min（4 ℃），取上清液為粗酶液。按 Boller 的方法[7]測定總幾丁質(zhì)酶活力。總幾丁質(zhì)酶活力的定義：在以上條件下催化相當于1 μmol N-乙?；咸前罚℅luNAc）所需的酶量為1個酶活單位（U）。按 Abeles 等的方法[8]測定β-1，3-葡聚糖酶活力。β-1，3-葡聚糖酶活力的定義：1 min產(chǎn)生1 μmol葡萄糖當量還原糖的酶量為1個酶活單位（U）。

2結(jié)果與分析

2.1BTH與JZG對珊西煙抗病性的誘導

使用BTH與JZG處理珊西煙第6片葉，6 d后在上部未處理的第7、8、9片葉接種TMV，接種2 d后枯斑反應完全顯現(xiàn)。由表1可見，BTH和JZG處理的第7、8、9片葉上的TMV枯斑數(shù)較對照差異顯著（P<0.05），據(jù)目測觀察，病斑大小無差異。TMV枯斑數(shù)以第7葉上最多，第8葉、第9葉次之，說明BTH、JZG在幼嫩組織上誘導的抗性較強，這也符合系統(tǒng)性誘導抗性的特性。說明BTH和JZG能誘導植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，減少了TMV的侵染。

2.2BTH和JZG處理珊西煙后總幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的變化

用BTH和JZG 處理珊西煙第6片葉，對照用清水處理，之后1、6、9、15、20 d及25 d取上部未處理葉片為樣本測定總幾丁質(zhì)酶的活性和β-1，3-葡聚糖酶活性，結(jié)果見圖1，BTH和JZG均能增強珊西煙葉片中總幾丁質(zhì)酶活性。從處理后 1 d 即可檢測到酶活性高于對照，BTH處理珊西煙后煙草葉組織中幾丁質(zhì)酶活性持續(xù)上升，處理后25 d內(nèi)維持高于對照的酶活性水平，且在處理后20 d達到最高，以后逐漸下降直至對照水平；JZG處理的珊西煙幾丁質(zhì)酶活性則在誘導后 15 d 達到最高水平。對β-1，3-葡聚糖酶的檢測發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果（圖2）：BTH和JZG處理珊西煙后，均使其葉片組織中β-1，3-葡聚糖酶活性增加，明顯高于對照水平，二者都能在誘導后15 d內(nèi)使β-1，3-葡聚糖酶活性保持高于對照的水平，以后酶活性緩慢下降。BTH和JZG處理珊西煙后，珊西煙葉片的總幾丁質(zhì)酶活性由低到高增加，以后呈下降趨勢，而β-1，3-葡聚糖酶活性雖然高于對照，但是從誘導1 d起就呈下降趨勢。

已有報道說明BTH能在許多作物上誘導SAR，在煙草上可誘導幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性增強[9]。JZG與BTH在珊西煙上具有相似的反應，都可誘導幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶，并且降低TMV的侵染率，說明JZG作為誘導劑可誘導植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應。

3討論

用BTH和JZG處理珊西煙下部葉片后，發(fā)現(xiàn)上部未處理葉片上TMV枯斑數(shù)目均較清水對照顯著減少。這一特性符合系統(tǒng)性獲得性抗性的主要特征：即經(jīng)過生物的或非生物因子誘導處理后，植株處理或未處理部位產(chǎn)生對隨后病原物侵染的抗性。

幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶是植物病程相關(guān)蛋白（PRs），也是SAR的重要標記。正常情況下，這2種酶只有低水平的組成型表達，當用誘導因子處理后，酶活性會迅速增加。這2種酶在離體條件下具有聯(lián)合抑菌活性，因此通常被看作是植物抵抗病原菌潛在的抗性機制[10-11]。BTH和JZG能誘導珊西煙體內(nèi)總幾丁質(zhì)酶活性和β-1，3-葡聚糖酶活性的提高，并且能維持較長一段時間，這對于誘導抗病效果是一個重要的影響因素。BTH和JZG誘導珊西煙后20 d內(nèi)，幾丁質(zhì)酶活性保持在較高的水平，β-1，3-葡聚糖酶活性也可在誘導后15 d內(nèi)維持在較高的水平。這說明BTH和JZG處理珊西煙植株15～20 d內(nèi)，植株是處在抗病反應時期。這為適時地使用BTH和JZG提供了參考的信息，即可在病害發(fā)生前的15 d內(nèi)使用誘導劑。

BTH是已經(jīng)商品化的誘抗劑，它能在許多作物上誘導抗性，而且其誘導植物的抗性與其誘導的幾丁質(zhì)酶活性和β-1，3-葡聚糖酶活性的增加有關(guān)[12]。本研究表明金針菇發(fā)酵液提取物與BTH有相似的抗TMV反應，且具有相似的酶活性變化趨勢。這說明JZG作為誘導劑可能誘導植物產(chǎn)生與BTH誘導（部分）相同的防衛(wèi)反應，也就是說金針菇發(fā)酵液的乙酸乙酯提取相中有起誘導作用的物質(zhì)，其有效成分還有待于今后進一步研究確認。

參考文獻：

[1]Hammerschmidt R，Kuc J. Induced resistance to disease in plants[M]. Dordrecht，Netherlands：Kluwet Academic Publishers ，1995.

[2]Ward E R，Uknes S J，Williams S C，et al. Coordinate gene activity in response to agents that induce systemic acquired resistance[J]. The Plant Cell，1991，3（10）：1085-1094.

[3]Ross A F. Systemic acquired resistance induced by localized virus infections in plants[J]. Virology，1961，14：340-358.

[4]Grlach J，Volrath S，Knauf-Beiter G，et al. Benzothiadiazole，a novel class of inducers of systemic acquired resistance，activates gene expression and disease resistance in wheat[J]. The Plant Cell，1996，8（4）：629-643.

[5]Kessmann H，Staub T，Hofmann C，et al. Induction of systemic acquired disease resistance in plants by chemicals[J]. Annual Review of Phytopathology，1994，32：439-459.

[6]王偉，唐文華，周洪友，等. BTH對厚皮甜瓜抗病性的誘導作用研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學學報，2000，5（5）：48-53.

[7]Boller T，Gehri A，Mauch F，et al. Chitinase in bean leaves：induction by ethylene，purification，properties，and possible function[J]. Planta，1983，157（1）：22-31.

[8]Abeles F B，Bosshart R P，F(xiàn)orrence L E，et al. Preparation and purification of glucanase and chitinase from bean leaves[J]. Plant Physiology，1971，47（1）：129-134.

[9]Friedrich L，Lawton K，Ruess W，et al. A benzothiadiazole derivative induces systemic acquired resistance in tobacco[J]. The Plant Journal，1996，10（1）：61-70.

[10]Mauch F，Mauch-Mani B，Boller T. Antifungal hydrolases in pea tissue：Ⅱ. inhibition of fungal growth by combinations of chitinase and β-1，3-glucanase[J]. Plant Physiology，1988，88（3）：936-942.

[11]Sela-Buurlage M B，Ponstein A S，Bres-Vloemans S A，et al. Only specific tobacco （Nicotiana tabacum） chitinases and β-1，3-glucanases exhibit antifungal activity[J]. Plant Physiology，1993，101（3）：857-863.

[12]Colson-Hanks E S，Deverall B J. Effects of 2，6-dichloroisonicotinic acid，its formulation materials and benzothiadiazole on systemic resistance to Alternaria leaf spot in cotton[J]. Plant Pathology，2000，49：171-178.