摘要：將出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）PA-2進(jìn)行液體發(fā)酵，發(fā)酵液用等體積正丁醇萃取3次，正丁醇萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去溶劑后進(jìn)行硅膠柱層析，以二氯甲烷和甲醇的混合液進(jìn)行梯度洗脫，每50 mL收集為1個(gè)餾分，共收集到50個(gè)餾分。生物測(cè)定結(jié)果表明，以二氯甲烷和甲醇（體積比20 ∶ 1）洗脫得到的餾分15～23對(duì)供試雜草野燕麥表現(xiàn)出了較強(qiáng)的活性，對(duì)野燕麥的除草抑制作用均為4級(jí)。合并餾分15～23，以二氯甲烷和甲醇（體積比15 ∶ 1）的混合液為展開劑進(jìn)行薄層層析，生物測(cè)定結(jié)果表明，Rf值范圍在0.19～0.83的活性條帶對(duì)野燕麥有不同程度的抑制活性。HPLC分析PA1條帶發(fā)現(xiàn)，該活性條帶主要含有2個(gè)組分，最大吸收峰在220 nm，其保留時(shí)間分別為59.015、65.948 min。

關(guān)鍵詞：出芽短梗霉；代謝產(chǎn)物；除草活性；分離純化；柱層析；薄層層析

中圖分類號(hào)：S482.4+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0199-03

收稿日期：2015-04-27

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31160371、30860165）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：2012BAD19B02）。

作者簡(jiǎn)介：程亮（1978—），男，河南林州人，碩士，副研究員，主要從事雜草生物防治方面的研究。Tel：（0971） 5313283；E-mail：liangcheng1979@163.com?；瘜W(xué)除草劑從應(yīng)用至今已有70多年的歷史，在提高農(nóng)作物產(chǎn)量方面起到不可低估的作用。但從20世紀(jì)70年代中期以來，抗藥性雜草種類一直呈上升趨勢(shì)[1-2]。同時(shí)，隨著環(huán)境保護(hù)呼聲的日益提高，高毒性農(nóng)藥的大量使用對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及生態(tài)環(huán)境造成的負(fù)面影響已引起世界范圍的廣泛關(guān)注。為了保護(hù)人類生存的環(huán)境和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，除草劑的研制與使用將嚴(yán)格受到環(huán)境和生態(tài)的制約[3]。微生物除草劑因其對(duì)目標(biāo)雜草選擇性強(qiáng)、環(huán)境負(fù)荷小和安全性高等優(yōu)勢(shì)而成為近年來雜草生物防治研究中一個(gè)較活躍的領(lǐng)域。

近年來，以微生物天然產(chǎn)物開發(fā)生物源除草劑或新穎除草劑的先導(dǎo)化合物引起了雜草科學(xué)家和農(nóng)藥化家學(xué)的極大興趣。利用微生物天然產(chǎn)物開發(fā)除草劑，即將細(xì)菌、真菌和放線菌等微生物在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的、具有抑制某些雜草生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，加工成可以直接使用的形態(tài)。

農(nóng)藥工業(yè)發(fā)掘具有除草活性微生物產(chǎn)生的毒素的努力主要集中在非病原土壤微生物和腐生微生物上，而不是植物病原菌。從微生物天然產(chǎn)物分離得到的植物毒素在貯藏、應(yīng)用、制劑的相容性和半衰期方面都比活體微生物具有優(yōu)越性，施用分離出來的毒素不會(huì)使非靶標(biāo)植物染病，其藥效通常不依賴環(huán)境因素，便于預(yù)測(cè)。毒素在分子大小、化學(xué)種類（肽類、萜類、二酮吡嗪、大環(huán)內(nèi)酯、酚類）和寄主專一性（病原菌從完全專一寄生到非專一寄生）上差別很大[4]。

出芽短梗霉（Aureobacidium pullulans）別稱出芽茁酶、芽生側(cè)茁酶、黑酵母及短梗霉等，是一類類酵母真菌，具有酵母樣和真菌菌絲體2種形態(tài)，據(jù)其生理特征和孢子產(chǎn)生的特征等將之歸屬于半知菌門（Deuteromycophyta ）叢梗孢目（Moniliates）短梗霉菌屬（Aureodacidium）。出芽短梗霉可產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，如胞外多糖、酶、抗菌素、黑色素及單細(xì)胞蛋白等，是一種很有開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景的多功能新型生物制品[5-13]。Prashanthi等從香澤蘭花序上分離到出芽短梗霉，該菌株代謝產(chǎn)物能引起香澤蘭花序?yàn)趺拱Y狀、花蕾早凋謝和抑制種子萌發(fā)[14]。李永龍等從楊樹葉片上分離純化的出芽短梗霉PA-2菌株代謝物對(duì)一些雜草具有除草活性[15]。

本試驗(yàn)以PA-2菌株為研究對(duì)象，利用樹脂柱層析、薄層層析及液相色譜等方法對(duì)該菌株除草活性組分進(jìn)行初步分離和純化，為深入研究除草活性物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)奠定一定的基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株

出芽短梗霉PA-2菌株。

1.2雜草

野燕麥（Avena fatua L.）。

1.3培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基（10 g酵母提取物、20 g蛋白胨、20 g葡萄糖和1 000 mL水）用于PA-2菌株的液體發(fā)酵培養(yǎng)。

1.4試劑

正丁醇（分析純），天津市百世化工有限公司生產(chǎn)；甲醇（分析純），天津市北辰方正試劑廠生產(chǎn)；二氯甲烷（分析純），上海廣諾化學(xué)科技有限公司生產(chǎn)；柱層析硅膠（300～400目），山東煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司生產(chǎn)；硅膠制備板（20 mm×20 mm），山東煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司生產(chǎn)；甲醇（色譜純），德國(guó)默克公司生產(chǎn)。

1.5儀器設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1100，埃朗科技國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司生產(chǎn)；真空泵SHZ-DⅢ，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司生產(chǎn)；高效液相色譜儀，天津博納艾杰爾科技有限公司生產(chǎn)。

1.6除草活性物質(zhì)的分離純化

將培養(yǎng)好的斜面種子接種于已消毒的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28 ℃下振蕩培養(yǎng)144 h，得到發(fā)酵液30 L。將發(fā)酵液于 5 000 r/min 離心20 min，將沉淀部分用10 L 80%丙酮浸泡過夜。冷凍離心去除沉淀，將上清液減壓旋轉(zhuǎn)濃縮去除丙酮，然后與發(fā)酵液合并。用等體積正丁醇萃取3次，合并正丁醇相濃縮至干，再用甲醇浸取2遍，過濾除去甲醇不溶物，真空濃縮除去甲醇，獲得粗品。

粗品經(jīng)硅膠柱層析分離，以二氯甲烷/甲醇不同的比例作洗脫液，分別為25 ∶ 1（1 500 mL）、15 ∶ 1（800 mL）、3 ∶ 1（500 mL）的流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，分部收集，根據(jù)生物活性跟蹤結(jié)果，將活性部分濃縮，得到淡黃色固體。用少量甲醇溶解，進(jìn)行TLC分離制備，展開液配比為二氯甲烷 ∶ 甲醇=15 ∶ 1，記錄除草活性物質(zhì)條帶Rf值，將具有除草活性最高的條帶刮下，用無水甲醇浸泡過夜，過濾，濾液減壓濃縮至10 mL左右，再用制備型HPLC進(jìn)一步分離純化（制備柱型號(hào)：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ，20 mm I.D.×250 mm，日本半井公司，流動(dòng)相為甲醇 ∶ 水=5 ∶ 95，流速16 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm）。整個(gè)分離純化過程以除草活性為生物活性跟蹤。

1.7生物活性測(cè)定

硅膠柱層析分離所得餾分生物活性測(cè)定采用種子萌發(fā)抑制法：首先，1%次氯酸鈉對(duì)野燕麥種子消毒3 min，然后用無菌水沖洗3次，室內(nèi)晾干備用。在直徑6 cm的培養(yǎng)皿中放入同皿底大小的雙層濾紙，滅菌后備用。在每皿中加入1 mL毒素稀釋液（為減少溶劑對(duì)種子萌發(fā)的影響，取粗毒素處理液 0.5 mL 均勻滴加到濾紙上，待濾紙完全干后再均勻滴加 0.5 mL 滅菌水），在上述處理的培養(yǎng)皿中均勻擺放20粒雜草種子，置于12 h光照/12 h黑暗、25 ℃條件下培養(yǎng)，并以滅菌水作對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)4次，3 d 后檢測(cè)種子萌發(fā)情況。

種子萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)以種子發(fā)芽長(zhǎng)度超過種子長(zhǎng)度計(jì)，按下列公式計(jì)算種子萌發(fā)抑制率。

種子萌發(fā)抑制率=（對(duì)照組種子萌發(fā)率-處理組種子萌發(fā)率）/對(duì)照組種子萌發(fā)率×100%。

除草抑制作用分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

2結(jié)果與分析

2.1粗毒素的柱層析和薄層層析

將除草活性物質(zhì)粗提物進(jìn)行硅膠柱層析，以二氯甲烷和甲醇（體積比25 ∶ 1、15 ∶ 1、3 ∶ 1）的混合液對(duì)其進(jìn)行梯度洗脫，每50 mL收集為1個(gè)餾分，共收集到了104個(gè)餾分。將所收集到的餾分分別用甲醇稀釋，利用種子萌發(fā)抑制法對(duì)野燕麥進(jìn)行除草活性測(cè)定，結(jié)果表明柱層析后所得到的餾分都對(duì)野燕麥表現(xiàn)出不同程度的活性，其中餾分15～23對(duì)野燕麥的抑制作用達(dá)到了4級(jí)，其余餾分活性較弱，如餾分31、餾分32對(duì)野燕麥的抑制作用為3級(jí)，餾分4、餾分5等對(duì)野燕麥的抑制作用為2級(jí)，餾分1、餾分2等對(duì)野燕麥的抑制作用為1級(jí)。

15～23餾分合并濃縮，進(jìn)行薄板層析（圖1），在展開劑二氯甲烷 ∶ 甲醇為20 ∶ 1時(shí)，可以分離出大致5個(gè)條帶，其Rf分別為0.83、0.50、0.40、0.29、0.19，依次標(biāo)記為 PA1、PA2、PA3、PA4、PA5，分別將其刮下回收，用甲醇溶解，除去硅膠粉，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，甲醇定容后，分別取等量的各回收樣品對(duì)野燕麥進(jìn)行生物活性測(cè)定。

生物測(cè)定結(jié)果表明，PA-2所分離出的5個(gè)條帶對(duì)野燕麥都具有不同程度的除草活性，PA1條帶芽長(zhǎng)抑制率為8373%，根長(zhǎng)抑制率為93.37%；PA2條帶對(duì)野燕麥種子芽長(zhǎng)抑制率為51.53%，根長(zhǎng)抑制率為 74.35%；PA3條帶對(duì)野燕麥種子芽長(zhǎng)抑制率為63.74%，根長(zhǎng)抑制率為63.60%；PA4條帶對(duì)野燕麥種子芽長(zhǎng)抑制率為73.39%，根長(zhǎng)抑制率為7434%；PA5條帶對(duì)野燕麥種子的芽長(zhǎng)抑制率為64.12%，根長(zhǎng)抑制率為75.69%。PA1和PA5在波長(zhǎng)為365 nm下吸收，顯示紫色色帶，PA2、PA3和PA4在波長(zhǎng)為254 nm先吸收，顯示熒光色帶。

2.2HPLC分析

2.2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇用紫外分光光度計(jì)對(duì)除草活性強(qiáng)的PA1條帶進(jìn)行紫外波譜區(qū)200～900 nm全波長(zhǎng)掃描，以確定樣品的最大吸收波長(zhǎng)，由圖2可見，在波長(zhǎng)為220 nm處有較大的吸收峰，且無次級(jí)吸收，故在以下的HPLC分析時(shí)選用220 nm為分析波長(zhǎng)。

2.2.2活性組分的 HPLC分析色譜分析條件：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ（20 mm I.D.×250 mm），流動(dòng)相為甲醇 ∶ 水為 5 ∶ 95，流速16 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，每次進(jìn)樣量15 μL。將PA-2的PA1條帶回收樣品通過有機(jī)濾膜，取樣 15 μL 進(jìn)行HPLC分析，由圖3可見，通過對(duì)圖譜的分析，可以看出在上述分析條件下該樣品可分離出2個(gè)較大的峰，其保留時(shí)間分別為59.015 min和65.948 min，可以看出保留時(shí)間是59015 min 的組分（標(biāo)記為A 峰）峰形較好，有點(diǎn)拖尾，后面有個(gè)保留時(shí)間為65.948 min的小峰（標(biāo)記為B峰）。分別將2個(gè)組分進(jìn)行收集制備，利用種子萌發(fā)抑制法測(cè)定其對(duì)野燕麥的活性（圖4為2個(gè)組分處理3 d的癥狀），可見2個(gè)組分峰都表現(xiàn)出了不同程度的除草活性，A峰對(duì)野燕麥種子的芽長(zhǎng)抑制率為64.81%，根長(zhǎng)抑制率為75.00%；B峰對(duì)野燕麥種子的芽長(zhǎng)抑制率為62.96%，根長(zhǎng)抑制率為52.34%。

3討論與結(jié)論

由于利用微生物代謝產(chǎn)物進(jìn)行除草劑開發(fā)的研究從本質(zhì)上是利用化合物的生物活性，類同于化學(xué)合成除草劑，所以更受到化學(xué)家們的重視。而深入研究微生物代謝產(chǎn)物，以期從中找到天然源的環(huán)保型化學(xué)除草劑之先導(dǎo)化合物，是天然產(chǎn)物利用研究的一個(gè)熱門領(lǐng)域。

已往研究曾采用薄層層析分離天然除草活性物質(zhì)[16]。但該法上樣量小，分離組分用于生測(cè)后難以有足夠的量進(jìn)行第2次分離。選用硅膠作固定相，二氯甲烷和甲醇混合溶劑作洗脫劑，對(duì)除草活性物質(zhì)進(jìn)行柱層析，取得了較好的分離效果。顯然本試驗(yàn)采用柱層析方法對(duì)出芽短梗霉除草活性物質(zhì)進(jìn)行粗分是可行的。使用柱層析分離，上樣量大，能保證獲得足夠多的除草活性物質(zhì)進(jìn)行再分離純化以及生測(cè)和結(jié)構(gòu)鑒定。

生物活性跟蹤貫穿于整個(gè)提取過程中是必須的。根據(jù)除草活性物質(zhì)分離流程的不同與要求，采用的生測(cè)方法也多種多樣。本研究通過摸索，過柱子后獲得的餾分確定了用培養(yǎng)皿濾紙法來進(jìn)行活性跟蹤。隨后進(jìn)行薄層層析板生物活性測(cè)定，確定薄層板上的除草活性條帶區(qū)域，達(dá)到進(jìn)一步去除雜質(zhì)的目的。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，有些除草活性組分中的物質(zhì)在254、365 nm紫外光下幾乎無吸收或者吸收很弱，但在別的波長(zhǎng)下卻有最大吸收。因此，用薄層層析分離除草活性物質(zhì)時(shí)不應(yīng)只刮取在254、365 nm下有熒光帶的部分生測(cè)，還應(yīng)刮取熒光帶之間無熒光的部分進(jìn)行生測(cè)，以防某些無熒光的活性物質(zhì)在分離過程中損失。采用柱層析分離，因?yàn)槭占疵撘菏沁B續(xù)的，有助于發(fā)現(xiàn)一些在紫外光下無吸收的次生代謝產(chǎn)物。但柱層析缺點(diǎn)是不直觀，將薄層層析和柱層析相結(jié)合有助于解決這一問題。最后HPLC分析制備獲得的除草活性組分的量較少，故采用容器直徑較小的瓶蓋進(jìn)行生物活性測(cè)定。

本試驗(yàn)利用薄層層析的方法，得到了5個(gè)條帶，并分別測(cè)定了其對(duì)野燕麥的除草活性，對(duì)5條帶回收樣品都進(jìn)行了HPLC分析，但除PA1條帶外，其他樣品的色譜圖分離效果不太理想，文中未列出。筆者認(rèn)為5個(gè)條帶的組分差別較大，其物化性質(zhì)也必存在諸多差異，故在同一條件下進(jìn)行HPLC分析時(shí)，其分離度難免會(huì)受到影響，同時(shí)，PA1的HPLC結(jié)果顯示，A峰和B峰2個(gè)保留時(shí)間分別為59.015 min和 65.948 min，這2個(gè)峰還是沒有完全分開，可能是難分離物質(zhì)，要求在今后分離工作中不斷選擇和試驗(yàn)分離效果較好的洗脫劑或展開劑，選擇適宜的洗脫方法對(duì)除草活性物質(zhì)進(jìn)行分離。為了達(dá)到較好的分離目的，特別到了分離后期，不僅可以改變流動(dòng)相，也可以改變固定相。所以對(duì)其分離條件的進(jìn)一步探索仍需進(jìn)行，此部分試驗(yàn)也正在進(jìn)行中。

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