張振良++郝德榮++陳國(guó)清++陸虎華+石明亮+冒宇翔++吳嘉點(diǎn)+黃小蘭+程玉靜+周廣飛++薛林

摘要：采用NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》中的20對(duì)簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）引物對(duì)市場(chǎng)上抽檢的蘇玉糯11、蘇玉糯901、蘇玉糯13、蘇玉糯14、蘇玉糯639等5個(gè)糯玉米品種進(jìn)行真實(shí)性鑒定。結(jié)果表明，每個(gè)抽檢品種與標(biāo)準(zhǔn)品種至少有6個(gè)差異位點(diǎn)，這5個(gè)品種均與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品種不同；此外，umc1545y2、umc1335y5、umc2105k3、umc1705w1、umc1125y3、umc2007y4、phi053k2、bnlg2305k4等8對(duì)引物多態(tài)性較好，在今后糯玉米品種鑒定中可優(yōu)先采用。

關(guān)鍵詞：糯玉米；SSR標(biāo)記；品種；鑒定；應(yīng)用

中圖分類號(hào)： S513.03文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0104-02

收稿日期：2015-05-15

作者簡(jiǎn)介：張振良（1987—），男，山東東平人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，研究方向?yàn)橛衩追肿舆z傳和育種。E-mail：zhenliang1110@163.com。

通信作者：薛林，研究員，研究方向?yàn)橛衩子N。E-mail：417803648@qq.com。糯玉米因其營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特、適口，越來(lái)越受到廣大消費(fèi)者歡迎。糯玉米種植面積越來(lái)越大，品種數(shù)量逐年上升，品種真實(shí)性鑒定需求也急劇增加。糯玉米育種中由于少數(shù)骨干親本的集中應(yīng)用，造成品種間遺傳基礎(chǔ)狹窄，僅從形態(tài)上鑒定存在一定困難，給玉米品種的生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)、使用以及種子管理部門的監(jiān)督帶來(lái)一定挑戰(zhàn)。隨著DNA指紋圖譜技術(shù)的發(fā)展，以簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）為代表的分子標(biāo)記技術(shù)逐漸成熟并應(yīng)用于農(nóng)業(yè)種子生產(chǎn)研究和種子質(zhì)量管理[1-2]。2014年，中國(guó)農(nóng)業(yè)部公布了一系列主要農(nóng)作物品種鑒定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，如NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》、NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》，代替了2007年公布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，使SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)農(nóng)作物品種真實(shí)性鑒定的方法更加完善和準(zhǔn)確。為進(jìn)一步明確SSR標(biāo)記在糯玉米品種真實(shí)性鑒定中的作用，本研究采用NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》標(biāo)準(zhǔn)鑒定5個(gè)疑似套牌糯玉米雜交種的真實(shí)性，同時(shí)探討SSR分子標(biāo)記技術(shù)在糯玉米品種真實(shí)性鑒定中的應(yīng)用前景。

1材料與方法

1.1材料

市場(chǎng)上抽檢的蘇玉糯11、蘇玉糯901、蘇玉糯13、蘇玉糯14、蘇玉糯639等5個(gè)糯玉米品種，疑是套牌種子依次編號(hào)為A、B、C、D、E，標(biāo)準(zhǔn)品種分別編號(hào)為A1、B1、C1、D1、E1。其中套牌種子由種子管理部門提供，標(biāo)準(zhǔn)品種由江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所玉米室提供。分別對(duì)每個(gè)樣品（品種）的5個(gè)個(gè)體單獨(dú)進(jìn)行分析。

1.2DNA提取

取約0.2 g玉米幼嫩葉片于液氮中研磨，轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，加入800 μL預(yù)熱65 ℃的CTAB提取緩沖液，混勻，水浴60 min，每隔10 min小心搖動(dòng)離心管；取出離心管，待冷卻至25 ℃，加入800 μL三氯甲烷 ∶ 異戊醇（24 ∶ 1），小心充分搖動(dòng)試管至有機(jī)相呈深綠色，室溫下于8 000 r/min離心 10 min；用剪口的1 mL槍頭將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，加入2/3體積預(yù)冷的異丙醇（-20 ℃），小心混勻；8 000 r/min 離心 2 min，棄上清液，用5 00 μL 70%乙醇清洗2次，棄上清液，干燥沉淀，加150 μL TE溶解。

1.3PCR擴(kuò)增

根據(jù)NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》標(biāo)準(zhǔn)，選用bnlg439w1、umc1335y5、umc2007y4、bnlg1940k7、umc2105k3、phi053k2、phi072k4、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg161k8、bnlg1702k1、umc1545y2、umc1125y3、bnlg240k1、phi080k15、phi065k9、umc1492y13、umc1432y6、umc1506k12等20對(duì)SSR標(biāo)記，均勻分布在玉米10對(duì)染色體上。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系（10 μL）為：1 μL 模板DNA （100～150 ng），上、下游引物（10 μmol/L）各0.2 μL、1 μL 10×Taq buffer、0.7 μL MgCl2、0.8 μL dNTP（2.5 mmol/L）、DNA Polymerase（2.5 U/μL）0.2 μL（TIANGEN），其余以超純水補(bǔ)足至所需體積。反應(yīng)液上加蓋15 μL石蠟油，以防反應(yīng)過(guò)程中水分蒸發(fā)。PCR程序?yàn)椋?94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共31個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃恒溫冷藏。

1.4非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及顯色。

PCR產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色。

1.5品種真實(shí)性鑒定標(biāo)準(zhǔn)

從樣品中隨機(jī)抽取5個(gè)單株作為檢測(cè)樣本。根據(jù)抽檢樣本電泳譜帶和標(biāo)準(zhǔn)品種電泳譜帶的一致性鑒定品種的真實(shí)性。結(jié)果按照農(nóng)業(yè)部頒布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》判定。當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)≥2，判定為不同；當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)=1，判定為近似；當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)=0，判定為極近似或相同。

2結(jié)果與分析

2.1糯玉米雜交種DNA檢測(cè)

對(duì)提取的糯玉米基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，提取的玉米基因組DNA主帶清晰一致，適合進(jìn)一步的SSR分析。

2.2品種內(nèi)遺傳一致性分析

20對(duì)引物中有umc1125y3、bnlg161k8、umc1506k12等3對(duì)引物在品種內(nèi)發(fā)生變異，均發(fā)生在抽檢的蘇玉糯13、蘇玉糯14、蘇玉糯639中，且都屬于在5個(gè)單株檢測(cè)重復(fù)中只發(fā)現(xiàn)1個(gè)不一致的情況（圖2）。20對(duì)引物對(duì)10個(gè)糯玉米雜交種的200次擴(kuò)增中，出現(xiàn)了共計(jì)5次品種內(nèi)變異，占2.5%，說(shuō)明品種內(nèi)變異較小，電泳譜帶比較結(jié)果是可靠的。

2.3糯玉米SSR鑒定分析

對(duì)抽檢的5個(gè)糯玉米雜交種和標(biāo)準(zhǔn)品種電泳譜帶比較可知，抽檢的蘇玉糯11與標(biāo)準(zhǔn)品種相比有11個(gè)差異位點(diǎn)，占引物總數(shù)的55%；蘇玉糯901與標(biāo)準(zhǔn)品種相比有7個(gè)差異位點(diǎn)，占引物總數(shù)的35%；蘇玉糯13與標(biāo)準(zhǔn)品種相比有6個(gè)差異位點(diǎn)，占引物總數(shù)的30%；蘇玉糯14與標(biāo)準(zhǔn)品種相比有9個(gè)差異位點(diǎn)，占引物總數(shù)的45%；蘇玉糯901與標(biāo)準(zhǔn)品種有6個(gè)差異位點(diǎn)，占引物總數(shù)的30%（表1）。按照農(nóng)業(yè)部頒布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程 SSR標(biāo)記法》，可判定待檢測(cè)的5個(gè)抽檢樣品與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品種為不同品種。

2.4引物多態(tài)性分析

umc1545y2在5個(gè)品種鑒定中均為差異位點(diǎn)（圖3），umc1335y5、umc2105k3、umc1705w1、umc1125y3在4個(gè)品種中均檢測(cè)到差異位點(diǎn)，umc2007y4、phi053k2、bnlg2305k4、bnlg1702k1 在3個(gè)品種中均檢測(cè)到差異位點(diǎn)（表1）。上述差異位點(diǎn)均在多個(gè)抽檢品種與標(biāo)準(zhǔn)品種間檢測(cè)到，說(shuō)明這些位點(diǎn)多態(tài)性較高。

3結(jié)論與討論

SSR分子標(biāo)記為共顯性遺傳，反映的是具體DNA片段的大小，既不受組織器官及發(fā)育階段的影響，也不受季節(jié)和環(huán)境因素的制約，與傳統(tǒng)田間種植鑒定相比，是一種更加快速、準(zhǔn)確鑒定品種真實(shí)性的方法，廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源分析和農(nóng)作物品種鑒定[3-7]。本研究采用SSR標(biāo)記對(duì)市場(chǎng)上抽檢的5份糯玉米品種進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，抽檢的5個(gè)糯玉米品種均與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品種不同，與田間鑒定結(jié)果一致，說(shuō)明SSR標(biāo)記鑒定結(jié)果可靠準(zhǔn)確。

引物篩選是SSR標(biāo)記鑒定品種真實(shí)性的關(guān)鍵，選用多態(tài)性高、染色體上分布均勻、穩(wěn)定性好的引物可有效提高工作效率、降低成本[7-8]。本研究采用農(nóng)業(yè)部公布的NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》中的前20對(duì)引物，這20個(gè)SSR位點(diǎn)的帶型清晰、穩(wěn)定性較好，平均分布在玉米的10條染色體上，其中有9對(duì)引物在至少3個(gè)糯玉米品種中檢測(cè)出差異位點(diǎn)，說(shuō)明這9對(duì)引物在糯玉米品種中多態(tài)性較好，在今后糯玉米品種鑒定中可優(yōu)先采用，以減少工作量、降低成本。

由于剩余遺傳效應(yīng)作用，品種內(nèi)變異普遍存在，品種內(nèi)變異導(dǎo)致品種內(nèi)不同個(gè)體之間重復(fù)帶型不一致，在品種真實(shí)性鑒定中會(huì)干擾判斷[3]。為避免糯玉米品種內(nèi)產(chǎn)生遺傳變異造成的誤差，本研究對(duì)每份糯玉米雜交種均采用5個(gè)單株重復(fù)。結(jié)果表明，20對(duì)引物只有3對(duì)引物發(fā)生品種內(nèi)變異，且5個(gè)單株檢測(cè)重復(fù)中只發(fā)現(xiàn)1個(gè)不一致情況，屬于可控范圍內(nèi)。針對(duì)品種內(nèi)重復(fù)性差的樣品，則需要擴(kuò)大檢測(cè)樣品的重復(fù)次數(shù)。

品種真實(shí)性鑒定作為種子生產(chǎn)和種子檢驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)，應(yīng)得到種子管理部門的高度重視。SSR標(biāo)記因其多態(tài)性高、重復(fù)性強(qiáng)的特點(diǎn)已被農(nóng)業(yè)部確定為品種真實(shí)性鑒定的有效方法。SSR分子標(biāo)記技術(shù)在種子管理工作中應(yīng)充分發(fā)揮作用，一方面應(yīng)用于市場(chǎng)糯玉米種子質(zhì)量監(jiān)督抽查，以阻止套牌侵權(quán)品種上市流通，保障農(nóng)民合法權(quán)益；另一方面應(yīng)用于糯玉米品種審定區(qū)域試驗(yàn)，以維護(hù)區(qū)試工作中的公正、公平，維護(hù)育種單位以及廣大種子生產(chǎn)者的利益。

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