黃瓊林+馬新業(yè)+詹若挺++陳蔚文

摘要：為了建立雞血藤基于rbcL基因的DNA條形碼鑒別體系，為其資源保護(hù)和用藥安全提供分子依據(jù)，采用商業(yè)試劑盒提取雞血藤樣品的基因組DNA，以及rbcL通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序；并從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲取雞血藤混偽品的rbcL基因序列。采用DNAMAN、ClustalX軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。結(jié)果表明：獲取的雞血藤及其混偽品rbcL序列均為498 bp，GC含量分布在40.0%～44.4%間，存在64處變異，種間遺傳距離遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于種內(nèi)遺傳距離?；趓bcL基因的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)能很好地區(qū)分雞血藤及其混偽品。因此，rbcL基因可用作雞血藤及其混偽品鑒別的DNA序列。

關(guān)鍵詞：雞血藤；rbcL條形碼；鑒別；混偽品

中圖分類號(hào)： R284.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0057-03

收稿日期：2015-05-14

基金項(xiàng)目：廣東省高等院校學(xué)科與專業(yè)建設(shè)專項(xiàng)資金（編號(hào)：2013CXZDA011）；國(guó)家工信部中藥材生產(chǎn)建設(shè)項(xiàng)目（編號(hào)：[2014]737號(hào)）；廣東省自然科學(xué)基金博士啟動(dòng)項(xiàng)目（編號(hào)：2015A030310519）。

作者簡(jiǎn)介：黃瓊林（1986—），男，廣東湛江人，博士，講師，主要從事分子生物學(xué)研究。E-mail：perfecthql@163.com。

通信作者：陳蔚文，博士，教授，主要從事創(chuàng)新中藥開(kāi)發(fā)與研究。E-mail：chenww@gzucm.edu.cn。雞血藤為中國(guó)常用大宗藥材，主產(chǎn)于廣東、廣西，味苦甘、性溫，具有補(bǔ)血活血、祛風(fēng)通絡(luò)之功效，用于治療月經(jīng)不調(diào)、血虛萎黃、麻木癱瘓、風(fēng)濕痹痛等病癥[1]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》收載的雞血藤藥材為豆科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn.）的干燥藤莖，但在市場(chǎng)流通過(guò)程中，大血藤（Sargentodoxa cuneata）、香花崖豆藤（Callerya cinerea）、魚(yú)藤（Derris trifoliata）、榼藤（Entada phaseoloides）等多種植物的藤莖被混淆為雞血藤藥材。這些混偽品的成分和功效與雞血藤均存在差異，嚴(yán)重影響了雞血藤的臨床用藥安全及其資源的可持續(xù)性利用。因此，有必要建立雞血藤及其常見(jiàn)混偽品的有效鑒別體系。

DNA條形碼是指利用一段短的標(biāo)準(zhǔn)DNA序列來(lái)實(shí)現(xiàn)物種的快速、準(zhǔn)確鑒別[2]。2012年，國(guó)家藥典委頒布了《中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則》，新版藥典或?qū)⑿略鯠NA條形碼鑒定，表明DNA條形碼具有良好的推廣和應(yīng)用價(jià)值。應(yīng)用于中藥材鑒別的推薦DNA條形碼片段主要位于葉綠體DNA、核糖體DNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)。rbcL基因編碼1，5-二磷酸核酮糖羧化酶大亞基，位于葉綠體DNA的大單拷貝區(qū)，是植物分子系統(tǒng)學(xué)研究中應(yīng)用最普遍的基因之一[3-5]。rbcL基因目前已被用于青天葵[6]、十大功勞[7]、溪黃草[8]等中藥的真?zhèn)舞b別，但尚未見(jiàn)其應(yīng)用于雞血藤及其混偽品的快速鑒別。因此，本研究分析雞血藤與4種常見(jiàn)混偽品的rbcL基因序列差異，為雞血藤的真?zhèn)舞b別和臨床用藥提供分子依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

雞血藤及其混偽品的rbcL基因序列來(lái)源于植物樣品或GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（表1）。雞血藤樣品包括植物葉片和干藥材，植物葉片采自廣州中醫(yī)藥大學(xué)城校區(qū)藥王山，藥材購(gòu)自廣東省湛江市連鎖藥店，均經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)鑒定為豆科植物密花豆。以雞血藤混偽品的拉丁學(xué)名為主題詞，從NCBI（National Center for Biotechnology Information）的GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）下載相應(yīng)物種的rbcL基因序列。

植物基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技公司；Ex Taq、10×Ex Taq buffer、dNTPs、DL2000 marker等PCR試劑購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；其他試劑均為分析純。引物合成和測(cè)序由北京六合華大基因科技股份有限公司廣州分公司完成。

1.2DNA提取

稱取100 mg雞血藤葉片或30 mg藥材，用無(wú)水乙醇擦拭表面，葉片用剪刀剪成小片狀或藥材用銅盅砸碎成小細(xì)塊后，置于研缽中，加入液氮快速研磨成粉末，參照植物基因組DNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取總DNA，并適當(dāng)延長(zhǎng)藥材樣品在提取液中的殘解和溫育時(shí)間。

1.3PCR擴(kuò)增

用于擴(kuò)增rbcL基因的引物為rbcLa-F（5′-ATGTCACCACAAACAGAG ACTAAAGC-3′）、rbcLa-R（5′-GTAAAATCAAGTCCACCRCG-3′），其中簡(jiǎn)并堿基R=A/G。PCR反應(yīng)體系包括5 μL 10×Ex Taq buffer 、3.0 μL dNTP（10 mmol/L）、各1.0 μL 正反向引物（10 μmol/L）、50 ng 模板DNA、0.5 μL Ex Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL），并用滅菌蒸餾水補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 0.5 min，55 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1.0 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。目的產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)確定，送樣純化并用上下游引物進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4序列分析

將測(cè)得的rbcL序列導(dǎo)入DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行拼接和校對(duì)，去掉5′和3′端的低可信區(qū)序列。將拼接序列進(jìn)行Blastn（Nucleotide Blast）比對(duì)確認(rèn)后，運(yùn)用Bankit軟件提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取序列登記號(hào)。采用ClustalX 1.83軟件進(jìn)行序列多重比對(duì)，并基于Kimura 2-Parameter（K2P）雙參數(shù)和Neighbor-Joining（NJ）鄰接法，利用MEGA 5.1軟件計(jì)算雞血藤及其混偽品的遺傳距離并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（1 000次重復(fù)bootstrap檢驗(yàn)各分支的支持率）。

2結(jié)果與分析

2.1DNA提取和PCR擴(kuò)增

不同雞血藤樣品的DNA提取效果不盡相同，葉片樣品DNA經(jīng)電泳檢測(cè)后條帶較為清晰，濃度為80 ng/mL；雞血藤藥材DNA條帶則呈彌散狀態(tài)，說(shuō)明藥材DNA存在較為明顯的降解和斷裂。取50 ng上述雞血藤DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得約600 bp的rbcL基因片段（圖1），目的產(chǎn)物條帶清晰，符合預(yù)期結(jié)果。取30 μL PCR產(chǎn)物送樣，進(jìn)行純化以及雙向測(cè)序，并將序列提交到GenBank，序列登記號(hào)見(jiàn)表1。

2.2序列差異分析

經(jīng)過(guò)序列多重比對(duì)分析，本研究獲得雞血藤及其混偽品rbcL序列共16條，長(zhǎng)度均為498 bp，GC含量分布范圍為 40.0%～44.4%（圖2）。雞血藤不同葉片和藥材樣品的rbcL序列完全一致，雞血藤及其混偽品之間存在64個(gè)差異位點(diǎn)，表明雞血藤及其混偽品的rbcL基因存在著較大程度的變異。

2.3遺傳距離分析

基于K2P模型計(jì)算的供試樣品間遺傳距離見(jiàn)表2。雞血藤種內(nèi)不同個(gè)體的遺傳距離為0.000，種內(nèi)沒(méi)有存在變異。

在不同物種之間，雞血藤與大血藤的種間遺傳距離最大，為0.081；與香花崖豆藤種間遺傳距離最小，為0.044。雞血藤與混偽品的種間距離遠(yuǎn)大于雞血藤的種內(nèi)距離，表明在rbcL基因中有足夠的差異鑒別雞血藤及其混偽品。

2.4聚類分析

以rbcL序列構(gòu)建的雞血藤及其混偽品的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)見(jiàn)圖3，16個(gè)樣品聚成2個(gè)主分支。不同個(gè)體的雞血藤先聚成1個(gè)小分支，然后再與同科的香花崖豆藤、魚(yú)藤和榼藤聚成1支；木通科的大血藤則單獨(dú)成為1支，系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)聚類結(jié)果與傳統(tǒng)分類學(xué)相符合。各分支的boostrap支持率均在70%以上，具有較好的單系性。基于rbcL基因建立的雞血藤及其混偽品系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)鑒別效果良好，表明rbcL基因可作為鑒別雞血藤及其混偽品的DNA標(biāo)準(zhǔn)序列。

3討論

對(duì)于雞血藤及其混偽品的鑒定，相關(guān)報(bào)道主要是采取性狀鑒別[9]、顯微鑒別[10]、理化鑒別[11]等傳統(tǒng)方法，但這些方法的鑒定標(biāo)識(shí)在生物學(xué)上增多為物種的遺傳表觀型，不僅受到遺傳因素的影響，還與物種的發(fā)育階段、生長(zhǎng)環(huán)境以及人類活動(dòng)如引種、炮制等有密切的關(guān)系，而且鑒別人員需有專業(yè)的知識(shí)背景，主觀性強(qiáng)，重復(fù)性和穩(wěn)定性差。翟明等也曾用RAPD分子標(biāo)記鑒別雞血藤及常見(jiàn)混偽品[12]，但RAPD鑒別物種需要多條引物，操作復(fù)雜，而且試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性容易受PCR試劑用量等多種因素的影響。

近年來(lái)，DNA條形碼技術(shù)已被公認(rèn)為中藥材鑒定的有效手段，它以遺傳信息DNA為鑒定依據(jù)，鑒別特征不因物種所處的發(fā)育階段和藥材的狀態(tài)影響，具有很好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。只需1個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因片段就可以完成絕大多數(shù)物種的鑒定，試驗(yàn)過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)化，容易實(shí)現(xiàn)物種鑒定的自動(dòng)化。DNA序列可以通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)和信息平臺(tái)進(jìn)行收集和共享，任何人都可以用來(lái)鑒定物種[13]。作為植物DNA條形碼的熱門片段之一，rbcL基因具有通用性好、易PCR擴(kuò)增和序列比對(duì)等優(yōu)點(diǎn)，在種屬水平有良好的鑒別效果[14]。本研究中，采用1對(duì)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，僅需1次試驗(yàn)就可以成功擴(kuò)增目的片段，簡(jiǎn)單快捷，并且測(cè)得序列在不同的雞血藤樣品中也有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。在雞血藤與混偽品的496 bp序列中，存在變異堿基64個(gè)，變異程度達(dá)12.9%，種間變異程度也遠(yuǎn)大于種內(nèi)變異程度。rbcL基因有足夠的差異區(qū)別雞血藤及其混偽品， 基于rbcL基因的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)也能直觀地證實(shí)這

一結(jié)論。

本研究采用DNA條形碼技術(shù)分析雞血藤及其混偽品的rbcL基因，序列中存在著多處鑒別位點(diǎn)，基于rbcL基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)可直觀地鑒別雞血藤及4種混偽品，為其資源保護(hù)和臨床用藥安全提供了一定的保障。

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