張 晟 高小平 陸 華 劉小章*

1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院(610041)；2.四川省人口和計(jì)劃生育科學(xué)研究所

·技術(shù)與方法·

可溶性人胎盤生長因子ELISA檢測試劑盒的建立及性能分析

張 晟1高小平2陸 華2劉小章2*

1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院(610041)；2.四川省人口和計(jì)劃生育科學(xué)研究所

目的：研發(fā)人血清及尿液可溶性胎盤生長因子(sPLGF)的ELISA檢測試劑盒并進(jìn)行性能測試。方法：以抗人PLGF單克隆抗體包被微孔板，加入重組sPLGF和生物素標(biāo)記的檢測抗體，形成抗原抗體復(fù)合體，加入鏈親合素辣根過氧化物酶和底物TMB實(shí)現(xiàn)比色反應(yīng)；從線性范圍、準(zhǔn)確度、精密度、樣品基質(zhì)及樣品前處理方法等指標(biāo)進(jìn)行性能評價，并與市售進(jìn)口同類產(chǎn)品進(jìn)行比較。結(jié)果：捕獲抗體的最適包被量為400ng/well，包被條件為4℃孵育16～20h，檢測抗體的最適工作濃度為1μg/ml，樣品最適反應(yīng)條件為37℃孵育2h，適合的封閉液及樣品稀釋液組合為3%BSA-PBS和0.1%BSA-PBS；驗(yàn)證該試劑盒的有效檢測范圍為15.6～2000pg/ml，準(zhǔn)確度為85%～115%；批次內(nèi)變異系數(shù)CV≤10%，批次間變異系數(shù)CV≤15%；其檢測范圍、準(zhǔn)確度、精密度、靈敏度及樣品適用范圍等與市售進(jìn)口試劑盒基本一致。結(jié)論：本項(xiàng)目開發(fā)的人sPLGF檢測試劑盒實(shí)現(xiàn)了人血清和尿液中的內(nèi)源sPLGF的定量檢測，其檢測性能穩(wěn)定、可靠，具有比進(jìn)口試劑盒檢測范圍更廣、價格更低的優(yōu)勢，可用于臨床檢測血液及尿液中的內(nèi)源性sPLGF水平。

人胎盤生長因子； 夾心ELISA；檢測試劑盒；性能測試

胎盤生長因子(PLGF)具有調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞生長和分化的作用[1-4]。已有研究證實(shí)，PLGF分泌異常與先兆子癇[5]、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩[6]、胎盤早剝[7]等胎盤功能障礙密切相關(guān)。與孕齡相同的正常妊娠婦女比較，先兆子癇妊娠婦女血清中sPLGF水平顯著降低[8-10]。PLGF作為預(yù)測先兆子癇的生物標(biāo)志物的觀點(diǎn)提出后[11-12]，大、小規(guī)模的臨床研究主要是利用ELISA方法檢測血清中游離的sPLGF水平[13]，而檢測尿液中游離sPLGF也可能成為預(yù)測先兆子癇的替代方法[14]。此外，研究發(fā)現(xiàn)習(xí)慣性流產(chǎn)婦女孕早期血清sPLGF水平顯著下降，且與羊水細(xì)胞非整倍體染色體的檢出率高度相關(guān)，包括13-三體、18-三體和21-三體[15-18]。目前，國內(nèi)采用ELISA檢測血清或尿液中游離sPLGF的相關(guān)報道較少，國產(chǎn)檢測試劑盒的研發(fā)緩慢。本研究建立用于人血清及尿液中sPLGF檢測的ELISA試劑盒，并對其檢測范圍、準(zhǔn)確度、精密度及其穩(wěn)定性等性能進(jìn)行檢測，與市售進(jìn)口試劑盒進(jìn)行比對。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

小鼠抗人PLGF單克隆抗體(MAB264，R&D公司)、生物素標(biāo)記山羊抗人PLGF 多克隆抗體 (BAF264，R&D公司)、重組人可溶性PLGF (sPLGF，264-PGB，R&D公司)、鏈親和素辣根過氧化物酶(DY998，R&D公司)、TMB(T4444，Sigma公司)、碳酸鹽緩沖液(pH9.6,自配)、PBS(pH7.4，自配)、牛血清白蛋白(羅氏公司)、Tween-20(上海生工生物工程股份有限公司)、脫脂奶粉(伊利集團(tuán))、胎牛血清(Thermo-Fisher公司)、可拆式96孔ELISA板(Corning公司)。M5多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices，Spectramax M5)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司, DK-S26)、渦旋混合儀(MX-E)、pH計(jì)(METTLER TOLEDO)、電子天平(METTLER TOLEDO)。

1.2 緩沖溶液

①碳酸鹽包被緩沖液：Na2CO31.59 g、NaHCO32.93 g溶于1000 ml超純水，pH 9.6～9.8，4℃保存。②PBS溶液：NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO42.9 g，KH2PO40.2 g，溶解于1000 ml超純水中，調(diào)節(jié)pH至7.4，室溫保存。③PBS-T溶液：PBS,0.05%Tween-20，室溫保存。④2N H2SO4終止液：將27.8 ml H2SO4緩緩加入472.2 ml純水中備用，室溫保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 雙抗夾心ELISA條件的選擇和優(yōu)化 根據(jù)雙抗體夾心ELISA設(shè)計(jì)原理，篩選并確定聚苯乙烯材料96微孔板為固相載體；選擇高特異性、高親和力的小鼠抗人PLGF單克隆抗體為捕獲抗體，生物素標(biāo)記的山羊抗人PLGF多克隆抗體為檢測抗體，鏈親和素標(biāo)記的辣根過氧化酶為藕聯(lián)酶，四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為酶促反應(yīng)底物，稀硫酸溶液為終止液。

1.3.1.1 捕獲抗體最適工作濃度的確定 采用“矩陣法”以不同濃度的捕獲抗體檢測不同濃度的sPLGF進(jìn)行正交試驗(yàn)，包被不同量 (10、20、50、100、200、400、8000、1000ng/well)的捕獲抗體，分別加入不同濃度的Human sPLGF標(biāo)準(zhǔn)品，用以檢測抗體檢測sPLGF結(jié)合量。

1.3.1.2 檢測抗體最適工作濃度的確定 采用“棋盤法”用不同濃度的檢測抗體檢測不同濃度的Human sPLGF進(jìn)行正交試驗(yàn)。包被適合濃度的捕獲抗體，分別加入不同濃度的Human sPLGF標(biāo)準(zhǔn)品，分別用工作濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、1.0、2.0μg/ml)的檢測抗體檢測sPLGF的量。

1.3.1.3 樣品適合孵育時間的確定 包被以“矩陣法”獲得的最適濃度4μg/ml，100μl/well的捕獲抗體，3%BSA-PBS封閉后分別加入不同濃度的Human sPLGF標(biāo)準(zhǔn)品分別孵育不同時間點(diǎn)，用“棋盤法”獲得的最適工作濃度1μg/ml的檢測抗體檢測sPLGF結(jié)合量。

1.3.2 試劑盒性能分析

1.3.2.1 線性范圍 依照上述已建立的檢測方法，檢測不同濃度的Human sPLGF標(biāo)準(zhǔn)品，分別進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，計(jì)算3次實(shí)驗(yàn)的平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，分析檢測值的準(zhǔn)確度(%)及CV(%)，并分析線性相關(guān)系數(shù)(R2)且應(yīng)≥0.990。

1.3.2.2 準(zhǔn)確度及批內(nèi)精密度 運(yùn)用已建立的檢測體系檢測線性范圍的最高(ULOQ)、高、中、低以及最低(LLOQ)5個不同濃度的Human sPLGF樣品，每個樣品設(shè)3個平行孔，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣品的檢測濃度，計(jì)算準(zhǔn)確度及3個平行孔間變異系數(shù)CV。

1.3.2.3 批次間精密度 運(yùn)用已建立的檢測體系對不同濃度的待測樣品分別測定5次，各個樣品每次測試均設(shè)4個平行孔，計(jì)算待測樣品的準(zhǔn)確度以及20個平行孔間的CV。

1.3.2.4 樣品基質(zhì)的影響 評估PBS、正常人血清及尿液基質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，以用PBS、正常血清和尿液配制的樣品稀釋液分別配制不同濃度的樣品，比較其檢測濃度與配制濃度的差異。

1.3.3 樣品前處理研究 分析不同臨床樣品(血清、尿液)前處理方式包括離心、沉降、pH調(diào)整等對ELISA檢測結(jié)果的影響。分別按3種方法處理正常血清或尿液。①方法A： 血清采樣后立即常溫2000g離心15min，轉(zhuǎn)移上清備用；尿液采樣后放置1h自然沉降，取上清液備用。②方法B：血清采樣后室溫放置30min，常溫2000g離心15min，取上清液備用；尿液采樣立即4 ℃，1000g離心10min，取上清液備用。③方法C：血清采樣后室溫放置30min，4℃，2000g離心15min，轉(zhuǎn)移上清備用；尿液采樣立即4 ℃1000g離心10min，調(diào)整pH7.2～7.4，取上清液備用。分別向上述3種不同處理方式獲得的正常血清或尿液添加已知濃度的sPLGF配制成不同濃度的待測樣品(S1、S2、S3)，用已建立的試劑盒檢測上述待測樣品中sPLGF的含量，每個樣品設(shè)3個平行孔，分析各樣品的準(zhǔn)確度及3個平行孔間的CV。

1.3.4 試劑盒檢測初步比對研究 分別配制線性范圍的ULOQ、高、中、低以及LLOQ 5個不同濃度的樣品，分別利用本試劑盒與市售進(jìn)口試劑盒(R&D公司)同步檢測，比較其性能特點(diǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 捕獲抗體最適工作濃度

捕獲抗體的包被量為200～800ng/well，檢測不同濃度的PLGF時，空白OD值相對較低，檢測值線性關(guān)系相對最佳，確定400ng/well為捕獲抗體的最適包被量(圖1)。

2.2 檢測抗體最適工作濃度

檢測抗體的工作濃度為1μg/ml時，空白OD值相對較低，線性關(guān)系相對最佳。確定1μg/ml為檢測抗體的最適工作濃度(圖2)。

2.3 樣品適合孵育條件

確定37℃，2h為樣品孵育的適合條件(圖3)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

本研究方法在2000～15.6 pg/ml范圍內(nèi)線性良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2=0.999，標(biāo)準(zhǔn)曲線的權(quán)重均在100±15%內(nèi)，估算其最低檢測限MDD為12pg/ml(表1，圖4)。

表1 雙抗夾心ELISA法檢測sPLGF的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性相關(guān)系數(shù)

圖4 雙抗夾心ELISA法檢測sPLGF標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5準(zhǔn)確度及批內(nèi)精密度

標(biāo)準(zhǔn)曲線的ULOQ、LLOQ樣品準(zhǔn)確度為80%～120%，批次內(nèi)平行組間CV均≤15%；標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的高、中、低濃度樣品的準(zhǔn)確度均在配制濃度的85%～115%，批次內(nèi)平行組間精密度(CV)均≤10%(表2)。高(1500pg/ml)、中(500pg/ml)、低(50pg/ml)濃度的sPLGF 檢測結(jié)果分別為1438.7±213.2、469.4±62.8 、42.9±6.2 pg/ml，準(zhǔn)確度分別為95.9%、93.9%、85.8%，均在配制濃度的85%～115%；批次間平行組的CV分別為14.8%、13.3%、14.5%，均≤15%。

表2 雙抗夾心ELISA檢測sPLGF的準(zhǔn)確度及批次內(nèi)精確度

2.6 樣品基質(zhì)

正常人血清或尿液基質(zhì)不會影響sPLGF與抗PLGF抗體之間的結(jié)合，能形成良好線性關(guān)系，表明樣品基質(zhì)對sPLGF檢測結(jié)果無明顯影響(圖5)。

2.7 樣品前處理

方法B處理后不同濃度樣品(S1、S2、S3)的檢測準(zhǔn)確度均在配制濃度的85%～115%，批次內(nèi)平行組間CV均≤10%，檢測值的準(zhǔn)確度和批次內(nèi)CV均優(yōu)于另外兩種方法，確定方法B為樣品合適的處理方式(圖6，表3)。

表3 雙抗夾心ELISA法檢測sPLGF不同前處理方法檢測性能比較

2.8 檢測性能

研發(fā)試劑盒和進(jìn)口試劑盒檢測樣品均為細(xì)胞上清、血清、血漿、尿液及組織勻漿，在檢測sPLGF的準(zhǔn)確度、批次間精密度、樣品范圍及操作時間等指標(biāo)方面相當(dāng)，且sPLGF檢測線性范圍比進(jìn)口試劑盒更廣，檢測費(fèi)用更低(表4)。

表4 研發(fā)試劑盒與進(jìn)口試劑盒檢測性能比較

3 討論

血清sPLGF水平檢測已不局限于高危人群先兆子癇的預(yù)測，有研究發(fā)現(xiàn)孕早期sPLGF水平降低與胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、非整倍體染色體胎兒顯著相關(guān)[15-18]。在唐氏綜合征篩查中，增加血清sPLGF檢測指標(biāo)可提高目前采用的母血清人絨毛膜促性腺激素β亞單位(β-hCG)、妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)等檢測方法的靈敏度[19，20]。此外，卵巢子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征患者卵泡液sPLGF水平的變化也拓展了sPLGF檢測技術(shù)在其它疾病診斷中的應(yīng)用[20]。

本研究應(yīng)用二步法雙抗體夾心ELISA的原理，通過系統(tǒng)的方法學(xué)研究，建立了一種定量檢測人血清和尿液中sPLGF的夾心ELISA檢測試劑盒，確定了參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，包括捕獲抗體最適包被量(400ng/well)、檢測抗體最適工作濃度(1μg/ml)、樣品孵育最適反應(yīng)條件(37℃孵育2h)、適合的封閉液及樣品稀釋液組合(3%BSA-PBS和0.1%BSA-PBS)等。本研究也發(fā)現(xiàn)，臨床收集的血清及尿液樣本若不進(jìn)行前處理則會影響檢測結(jié)果，尤其造成某些樣品的假陽性，如血清樣品發(fā)生輕度及以上的溶血現(xiàn)象，尿液樣品出現(xiàn)絮狀沉淀，均可能造成檢測的假陽性。但對血清以及尿液采取離心、沉降、pH調(diào)整等適當(dāng)處理，可完全避免了假陽性的發(fā)生。

總之，研制的試劑盒性能測試表明，檢測線性濃度范圍廣(15.6～2000pg/ml)，準(zhǔn)確度較高(85%～115%)，檢測數(shù)據(jù)穩(wěn)定性良好(批次內(nèi)變異系數(shù)CV≤10%，批次間變異系數(shù)CV≤15%)。檢測性能包括準(zhǔn)確度、精密度、樣品范圍及操作時間等方面指標(biāo)與進(jìn)口試劑盒相當(dāng)，且具有檢測適合范圍更廣、價格更低等優(yōu)勢，可用于臨床檢測血液及尿液中的內(nèi)源性sPLGF水平。

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[責(zé)任編輯：張 璐]

Performance analysis of a ELISA kit for detection of soluble placental growth factor

Zhang Sheng1, Gao Xiaoping2, Lu Hua2, Liu Xiaozhang2,*

1.SichuanUniversity,WestChinaCollegeofPreclinicalMedicineandForensicMedicine(610041); 2.SichuanInstituteofPopulationandFamilyPlanning

Objective: To develop an ELISA kit for detecting soluble placental growth factor (sPLGF) in human serum and urine, and analyze its performance. Methods: A specific monoclonal antibody to human sPLGF was pre-coated onto a microplate. Recombinant sPLGF and biotin-conjugated detection antibody were added to form a complex. A streptavidin HRP was covalently linked to the detection antibody, allowing for a colorimetric reaction in the presence of substrate TMB. The performance index of the kit, including line range, accuracy, intra-assay precision, inter-assay precision, sensitivity, and sample substrate and preprocessing were detected and compared with an imported commercial kit (R&D). Results: The optimal coating amount of capture antibody was 400 ng/well of the ELISA kit. The coating conditions were as following: the wells were pre-coated at 4℃ for 16-20 hours; the optimum working concentration of the detection antibody was 1μg/ml; the samples were incubated at 37℃ for 2 hours; and the best blocking buffer and assay diluents were 3% BSA/ PBS or 0.1% BSA/PBS buffer. The detection and quantification of human sPLGF was verified within the range of 15.6-2000 pg/ml. The linearity of the assay was 85%-115%. The intra-assay and inter-assay variability with coefficients of variation were ≤ 10 % and ≤15%, respectively. The performance was comparable to the commercial kit (R&D) with a good consistency in most aspects as line range, recovery, precision and sensitivity and sample scope of application. Conclusion: The developed human sPLGF ELISA kit realizes the quantitative measurement of endogenous sPlGF level in human serum and urine samples. This quantitative immunoassay kit is stable and reliable with advantages of wider testing range and lower cost compared to the imported kit, which can be used clinically to determine human sPLGF in serum and urinary.

Placental growth factor, Sandwich ELISA, Detection Kit, Performance analysis

四川省科研院所科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(13010137)

2016-06-14

2016-10-12

10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.12

*通訊作者：hilda_xiaozhangliu@163.com

*Correspondingauthor:Email:hilda_xiaozhangliu@163.com