林家燕，傅龍云，陳明生，王亞斌，曹豐Δ

(1.解放軍第113醫(yī)院 麻醉科，浙江 寧波 315040；2.舟山警備區(qū)醫(yī)院 外科，浙江 舟山 316000；3.解放軍第301醫(yī)院 心內(nèi)科，北京 271001)

鞘內(nèi)注射阿片κ-受體激動劑U50，488H預(yù)處理對心肌缺血/再灌注損傷的保護作用

林家燕1，傅龍云2，陳明生1，王亞斌3，曹豐3Δ

(1.解放軍第113醫(yī)院 麻醉科，浙江 寧波 315040；2.舟山警備區(qū)醫(yī)院 外科，浙江 舟山 316000；3.解放軍第301醫(yī)院 心內(nèi)科，北京 271001)

目的 探討鞘內(nèi)注射阿片κ-受體激動劑U50，488H預(yù)處理對在體大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及相關(guān)機制。方法 選擇健康成年雄性SD大鼠隨機分為5組：假手術(shù)組(Sham)，模型組(IR)，靜脈注射高劑量組(IV1)，靜脈注射低劑量組(IV2)，鞘內(nèi)注射組(IT)，采用大鼠在體心肌缺血/再灌注模型，Sham組完成所有手術(shù)操作，但左冠狀動脈結(jié)扎線不打結(jié)，不予靜脈或鞘內(nèi)藥物注射；IR組完成模型后，予心臟缺血30 min后再灌注120 min處理，不予靜脈或鞘內(nèi)藥物注射；IV1組、IV2組及IT組在建立模型前1 h分別給予U50，488H預(yù)處理，IV1及IV2組分別靜脈注射U50，488H 0.1 mg/kg及0.01 mg/kg，IT組鞘內(nèi)注射U50，488H 0.01 mg/kg，而后予心臟缺血30 min后再灌注120 min處理，術(shù)后觀察大鼠心臟超聲、心肌天狼猩紅染色，血漿降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)及內(nèi)皮素(endothelin，ET)含量等指標(biāo)改變。結(jié)果 心臟超聲結(jié)果顯示：與IR組(EF%=35.4±1.1，F(xiàn)S%=21.1±1.1)比較，IT組(EF%=49.1±1.2，F(xiàn)S%=27.1±1.0)及IV1組(EF%=46.3±2.2，F(xiàn)S%=26.6±0.6)均可明顯改善缺血/再灌注損傷后大鼠心臟收縮功能(P<0.05)，而IV2組(EF%=34.8±1.4，F(xiàn)S%=21.4±1.6)心功能無明顯變化。心肌天狼猩紅染色結(jié)果提示：與IR組比較，IT組及IV1組心肌纖維化損傷明顯減輕，而IV2組則無明顯改善。ELISA結(jié)果顯示：與IR組比較，IT組及IV1組血清CGRP濃度明顯增加(P<0.05)，ET濃度明顯減少(P<0.05)，而IV2組均無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論 鞘內(nèi)注射阿片κ-受體激動劑U50，488H的預(yù)處理可明顯改善大鼠心肌缺血/再灌注損傷后的心功能，并抑制心肌纖維化，其機制可能與調(diào)節(jié)CGRP、ET的釋放有關(guān)。

鞘內(nèi)注射；阿片κ-受體；心肌缺血/再灌注；降鈣素

一直以來，心血管疾病都是危害人類健康的主要“殺手”之一，近年來對于心血管疾病的發(fā)病機制及防治方法的研究仍舊是科學(xué)家們關(guān)注的熱點，亦是人類至今尚未攻克的難題。自阿片受體于1973年被發(fā)現(xiàn)以來，眾多研究表明其參與了心血管活動的調(diào)節(jié)：δ受體主要與升壓有關(guān)；通過中樞降低心血管交感神經(jīng)張力主要是μ與κ受體，進一步研究表明，在以上三種阿片受體中，對心血管系統(tǒng)的中樞性調(diào)節(jié)作用最強的為κ受體[1-3]。但是，將阿片類藥物用于缺血/再灌注預(yù)處理及后處理方面的研究多處于動物試驗階段，部分原因可能是實驗時的用藥劑量遠遠高于臨床應(yīng)用劑量，加之阿片類藥物作為毒麻藥品，應(yīng)用受到嚴格管控，所以臨床應(yīng)用比較困難。本研究通過鞘內(nèi)給藥途徑，小劑量注射選擇性阿片κ-受體激動劑U50，488H于心肌缺血前預(yù)處理，探討中樞κ-受體介導(dǎo)的心肌保護作用及其可能的作用機制，為阿片類藥物臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗使用健康雄性SD(Sprague Dawley)大鼠，200 g±25 g[第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供，合格證號：SCXK(陜)2012-0007]。U50，488H(美國Sigma-公司)；CGRP試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，ET試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。PowerLab生物信號采集處理系統(tǒng)(澳大利亞AD Instruments公司)，Vevo 2100 超高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)(加拿大Visual Sonics公司)Spectra Max 100酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)，倒置顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物選擇及分組：50只SD大鼠隨機分為5組：假手術(shù)組(Sham，n=10)，模型組(IR，n=10)，靜脈注射高劑量組(IV1，n=10)，靜脈注射低劑量組(IV2，n=10)，鞘內(nèi)注射組(IT，n=10)。Sham組：大鼠給與心臟缺血/再灌注模型制備操作，但左冠狀動脈結(jié)扎線不打結(jié)，不予靜脈或鞘內(nèi)藥物注射；IR組：為模型對照組，大鼠制備心臟缺血/再灌注模型，予心臟缺血30 min后再灌注120 min處理，不予靜脈或鞘內(nèi)藥物注射；IV1組及IV2組：為靜脈藥物注射組，模型制作同IR組，在心肌缺血前1 h分別予靜脈注射U50，488H 0.1 mg/kg及0.01 mg/kg(生理鹽水稀釋至10 μL，后再給予生理鹽水10 μL沖管)；IT組：為鞘內(nèi)藥物注射組，模型制作同IR組，在心肌缺血前1 h予鞘內(nèi)注射U50，488H 0.01 mg/kg(生理鹽水稀釋至10 μL，后再給予生理鹽水10 μL沖管)。本研究中所有動物實驗均遵循《實驗動物保護條例》。

1.2.2 大鼠心肌缺血/再灌注模型制作[4]：大鼠禁食12 h，2%異氟烷麻醉后行氣管插管，連接動物呼吸機，室內(nèi)空氣通氣，潮氣量20～30 mL/kg，呼吸頻率70～80次/分。行右頸總動脈置管，連接Power Lab系統(tǒng)有創(chuàng)測壓，并監(jiān)測心電圖(electrocardiogram,ECG)、平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)和心率(heart rate,HR)。沿左鎖骨中線，切開皮膚2cm，于第4、5肋間處打開胸腔，剪開心包并輕柔擠出心臟。在左冠狀動脈處(動脈圓錐與左心耳之間)用6-0縫線縫一線結(jié)，放回心臟。穩(wěn)定15 min，收緊線結(jié)后即形成左側(cè)冠狀動脈閉塞所致的心肌缺血模型：左側(cè)冠狀動脈支配的局部心肌發(fā)紺、血壓下降，心電圖呈心梗改變(ST段抬高或降低等)。術(shù)中平均動脈壓低于30 mmHg或出現(xiàn)頑固性室性心律失常的大鼠棄去不用。

1.2.3 大鼠鞘內(nèi)注射：采用Mestre法[5]，參考文獻操作，穿刺成功后予鞘內(nèi)注射U50，488H 0.01 mg/kg(生理鹽水稀釋至10 μL)，后再給予生理鹽水10 μL沖管，出現(xiàn)肢體癱瘓的大鼠棄去不用。

1.2.4 超聲心動圖分析大鼠左心室功能：每組大鼠分別于術(shù)前及術(shù)后三天行超聲心動圖分析：2%異氟烷麻醉后，取仰臥位，應(yīng)用Vevo 2100 超高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)對大鼠進行心臟超聲檢查，分別記錄二維及M型圖像，測量大鼠左室收縮末期容積及左室舒張末期容積，計算左室射血分數(shù)EF(%)及短軸收縮率FS(%)。

1.2.5 大鼠心肌天狼猩紅染色：每組取3只大鼠，術(shù)后一個月處死，取部分左心室心肌組織，經(jīng)甲醛固定、脫水、石蠟包埋切片后，天狼猩紅染液染色1 h，流水沖洗10 min，常規(guī)脫水、透明、樹膠封固。染色結(jié)果中富含膠原蛋白的纖維化組織區(qū)域呈紅色，正常心肌細胞組織呈黃綠色。每只大鼠隨機選取10個顯微鏡視野(×200)，應(yīng)用Image J圖像分析程序，分析計算心肌切片中天狼猩紅染色的纖維組織面積占總面積的百分比，從而推斷心肌的纖維化程度。

1.2.6 大鼠血漿CGRP及ET含量檢測：術(shù)后3 d，每組取7只大鼠，經(jīng)頸動脈抽取2～3 mL血液標(biāo)本加入到100 g/L乙二胺四乙酸鈉30 μL抑肽酶40 μL的試管中，混勻后3000 r/min離心10 min，分離血清，-20 ℃下保存待測定。采用ELISA法測定血清中 CGRP及ET含量。CGRP試劑盒及ET試劑盒的操作程序嚴格按照說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 心臟超聲 心臟超聲結(jié)果顯示見圖2：與IR組(EF%=35.4±1.1，F(xiàn)S%=21.1±1.1)比較，IT組(EF%=49.1±1.2，F(xiàn)S%=27.1±1.0)及IV1組(EF%=46.3±2.2，F(xiàn)S%=26.6±0.6)均顯著增加(P<0.05)，而IV2組(EF%=34.8±1.4，F(xiàn)S%=21.4±1.6)則無明顯變化。

圖1 各組大鼠超聲心電圖變化情況Fig.1 Changes of ECG in each group

圖2 各組大鼠EF%與FS%變化情況*P<0.05Fig.*P<0.05

2.2 心肌天狼猩紅染色改變 見圖3：紅色區(qū)域為纖維化組織，心肌細胞組織呈黃綠色；各組心肌切片中天狼猩紅染色的纖維組織面積占總面積的百分比見圖4，結(jié)果顯示：與IR組(53.5±3.02)%比較，IT組(27.1±3.57)%及IV1組(26.8±2.50)%心肌纖維化程度明顯減輕，而IV2組(50.6±1.82)%則無明顯改善。

圖3 各組大鼠心肌天狼猩紅染色情況(×200)Fig.3 Histopathological changes of myocardium in each group (×200)

圖4 各組大鼠心肌纖維化改變情況±s)*P<0.05Fig.4 Content change of myocardial fibers in each ±s)*P<0.05

2.3 大鼠血漿CGRP及ET含量變化 如圖5：術(shù)后第3天，IT組(287.4±6.90)與IV1組(278.2±7.29)大鼠血清中CGRP含量明顯高于IR組(234.3±8.38)pg/mL(P<0.05)，而ET濃度[IT組：(176.5±8.15)pg/mL，IV1組：(177.67±9.73)pg/mL]明顯低于IR組(233.07±7.30)pg/mL(P<0.05)；IV2組[CGRP：(233.27±12.32)pg/mL，ET：(215.37±11.76)pg/mL]與IR組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖5 各組大鼠血漿CGRP及ET含量變化情況*P<0.05Fig.5 Content change of plasma levels of CGRP and ET in each ±s)*P<0.05

3 討論

心肌缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning，IPC)，是近年來研究心肌保護的一項重要發(fā)現(xiàn)，Schultz等[6]研究表明，阿片類受體在心肌缺血預(yù)適應(yīng)中扮演了重要角色。除了分布于外周調(diào)節(jié)心血管功能的阿片受體外，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中亦有大量阿片受體分布于參與心血管調(diào)節(jié)的相關(guān)核團中。Groban等[7]研究發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射嗎啡可減少大鼠心臟缺血/再灌注損傷所致的心肌梗死面積。進一步研究還發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射嗎啡預(yù)處理，可模擬心肌IPC或靜脈注射嗎啡預(yù)處理對缺血/再灌注心肌的保護作用，且μ、δ和κ三種阿片受體，均參與介導(dǎo)了這一作用[8-9]。

目前普遍認為，與阿片類藥物成癮性相關(guān)的可能為μ和δ受體[10]，此外，成癮性亦與藥物使用劑量等相關(guān)。嗎啡為非選擇性阿片受體激動劑，對體內(nèi)μ、δ和κ三種阿片受體可同時興奮，因此在應(yīng)用的同時存在藥物成癮性的風(fēng)險。本研究中選擇性阿片κ-受體激動劑U50，488H鞘內(nèi)注射組(0.01 mg/kg)與靜脈注射1組(0.1 mg/kg)，均發(fā)現(xiàn)U50，488H可改善在體大鼠心肌缺血/再灌注損傷后的心臟收縮功能，并緩解心肌纖維化損傷，而靜脈注射2組(0.01 mg/kg)卻無明顯保護作用，說明鞘內(nèi)注射組的有效劑量遠低于靜脈注射組。因此，鞘內(nèi)小劑量應(yīng)用選擇性阿片κ-受體激動劑預(yù)處理，既可達到心肌IPC的保護作用，又減少了藥物成癮性的風(fēng)險，更加適合臨床應(yīng)用。

降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)是體內(nèi)的一種非腎上腺素能、非膽堿能的強效擴張血管的神經(jīng)遞質(zhì)，對調(diào)節(jié)血管的舒縮功能具有非常重要的作用，在一定范圍內(nèi)，CGRP可緩解因血管收縮因子的上調(diào)而帶來的損傷[11]。在關(guān)于心肌IPC早期和延期的心肌保護研究中發(fā)現(xiàn)[12-14]，缺血或藥物預(yù)處理均可使內(nèi)源性CGRP的釋放增加，因此，CGRP可能在IPC這種保護作用中起重要作用。翁立軍等[15]研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室內(nèi)注射嗎啡預(yù)處理組和缺血預(yù)處理組，動物血清中的CGRP水平明顯高于I/R組，而在側(cè)腦室內(nèi)注射嗎啡預(yù)處理前，分別注射μ、δ和κ三種阿片受體拮抗劑于側(cè)腦室，CGRP的釋放也同時降低，進一步表明神經(jīng)中樞中μ、δ和κ三種受體，均參與了側(cè)腦室內(nèi)注射嗎啡預(yù)處理的心肌保護效應(yīng)，且這種機制可能與影響內(nèi)源性CGRP的釋放相關(guān)[16]。本研究中，鞘內(nèi)注射組與靜脈注射1組大鼠血漿CGRP濃度明顯高于模型組及靜脈注射2組，說明鞘內(nèi)小劑量注射選擇性阿片κ-受體激動劑U50，488H所產(chǎn)生的心肌保護效應(yīng)可能與影響大鼠內(nèi)源性CGRP釋放有關(guān)，而小劑量(0.01 mg/kg)靜脈注射U50，488H則無法增加CGRP的釋放。

內(nèi)皮素(endothelin，ET)是一類具有強烈縮血管作用，并能刺激多種心血管細胞增殖、肥大及產(chǎn)生致炎癥效應(yīng)的多肽，它由血管內(nèi)皮細胞等分泌釋放，是缺血、缺氧及再灌注損傷時產(chǎn)生的一種致?lián)p傷因子，對心血管系統(tǒng)的病理生理功能有著重要的影響[17]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮素的合成受到多種因素及其自身調(diào)節(jié)，血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、心肌細胞、成纖維細胞、白細胞及巨噬細胞等都能夠合成內(nèi)皮素。本研究中，鞘內(nèi)注射組與靜脈注射1組大鼠血清ET濃度顯著低于模型組，而靜脈注射2組與模型組比較無明顯差異，說明鞘內(nèi)注射U50，488H還可能通過減少內(nèi)源性ET釋放，從而舒張冠脈、減輕心肌細胞異常增殖肥大及緩解心肌炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生的心肌保護效應(yīng)，而小劑量(0.01 mg/kg)靜脈注射U50，488H則無明顯影響，相關(guān)機制還有待進一步研究。

綜上所述，鞘內(nèi)小劑量(0.01 mg/kg)注射選擇性阿片κ-受體激動劑U50，488H，可顯著改善心臟收縮功能，緩解心肌損傷及心肌纖維化改變，其作用機制可能與影響內(nèi)源性CGRP及ET釋放有關(guān)，本研究選用鞘內(nèi)注射的給藥途徑較靜脈給藥，可顯著減少阿片類藥物的有效劑量，減少藥物成癮風(fēng)險，為阿片類藥物臨床應(yīng)用提供了一定的參考。

[1] Pugsley MK.The diverse molecular mechanisms responsible for the actions of opioids on the cardiovascular system[J].Pharmacol Ther,2002,93(1):51-75.

[2] Wittert G,Hope P,Pyle D.Tissue distribution of opioid receptor gene expression in the rat[J].Biochem Biophys Res Commun,1996,218(3):877-881.

[3] Gross GJ.Role of opioids in acute and delayed preconditioning[J].J Mol Cell Cardiol,2003,35(7):709-718.

[4] Li R,Wong GT,Wong TM,et al.Intrathecal morphine preconditioning induces cardioprotection via activation of delta,kappa,and mu opioid receptors in rats[J].Anesth Analg,2009,108(1):23-29.

[5] Mestre C,Pélissier T,Fialip J,et al.A method to perform direct transcutaneous intrathecal injection in rats[J].J Pharmacol Toxicol,1994; 32(4):197-200.

[6] Schultz JE,Rose E,Yao Z,et al.Evidence for involvement of opioid receptors in ischemic preconditioning in rat hearts[J].Am J Physiol,1995,268(5):H2157-H2161.

[7] Groban L,Vernon JC,Butterworth J.Intrathecal morphine reduces infarct size in a rat model of ischemia-reperfusion injury[J].Anesth Analg,2004,98(4):903-909.

[8] Li R,Wong GT,Wong TM,et al.Intrathecal morphine preconditioning induces cardioprotection via activation of delta,kappa,and mu opioid receptors in rats[J].Anesth Analg,2009,108(1):23-29.

[9] 李銳，張野，張健，等.中樞阿片受體介導(dǎo)鞘內(nèi)注射嗎啡對大鼠缺血后心肌的保護作用[J].中國藥理學(xué)通報，2008，24(5)：676-680.

[10] 張力，李積勝.阿片類物質(zhì)成癮機制研究進展[J].國際精神病學(xué)雜志，2007，37(4)：18-221.

[11] Vaage J,Valen G.Preconditioning and cardiac surgery[J].Ann Thorac Surg,2003,75(2):S709-S714.

[12] Song QJ,Li YJ,Deng HW.Early and delayed cardioprotection by heat stress is mediated by calcitonin gene-related peptide[J].Arch Pharmacol,1999,359(6):477-483.

[13] Peng J,Lu R,Deng HW,et al.Involvenment of alpha-calcitonin gene-related-peptide in monophosphoryl lipid A-induced delayed preconditioning in rat hearts[J].Eur J Pharmacol,2002,436(1):89-96.[14] Burgdrof C,Dendorfer A,Kurz T,et al.Calcitonin gene-related-peptide dose not interct with sympathetic activity in myocardial ischemia[J].Regul Pept,2005,125(1):99-102.

[15] 翁立軍，張野，李銳，等.中樞嗎啡預(yù)處理對在體大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護作用[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，12(2)：45-47.

[16] 陸姚，張野，李銳，等.阿片受體介導(dǎo)的中樞嗎啡預(yù)處理對在體大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護作用[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，44(1)：49-52.

[17] 朱妙章，袁文俊，吳博威，等.心血管生理學(xué)與臨床[M].北京：高等教育出版社，2004：271-280，445-450.

(編校：師維康)

Protective effect of κ-opioid receptor agonist U50, 488H pretreatment by intrathecal injection on myocardial ischemia/reperfusion injury

LIN Jia-yan1, FU Long-yun2, CHEN Ming-sheng1, WANG Ya-bin3, CAO Feng3Δ

(1.Department of Anesthesiology, 113 Hospital of People’s Liberation Army, Ningbo 315040 China; 2.Department of Surgery,Zhoushan Garrison Hospital, Zhoushan 316000 China; 3.Department of Cardiology, 301 Hospital of Peopl’s Liberation Army,Beijing 271001, China)

ObjectiveTo explore the effect and mechanism of intrathecal injecting κ- opioid receptor agonist U50, 488H on the rats with myocardial ischemia/reperfusion injury.Methods50 Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups (n=10): sham group (Sham), ischemia/reperfusion group (IR), high-dose intravenous injection group (IV1), low-dose intravenous injection group (IV2), and intrathecal injection group (IT).In sham group the rats were followed by the modeling step without ligation of the left coronary and no drug injection by intravenous or intrathecal; in IR group the rats were underwent 30 minutes of myocardial ischemia followed by 120 minutes of reperfusion, and were not treated with any drug.All the rats in IV1, IV2 and IT groups were intravenous injected with U50, 488H at 1 hour before they were underwent myocardial ischemia/reperfusion as in IR group.IV1 and IV2 groups were intravenous injected with U50, 488H respectively at the dose of 0.1 mg/kg and 0.01 mg/kg, while the IT group was intrathecal injected with U50, 488H at the dose of 0.01mg/kg.All the rats from 5 groups were observed with cardiac ultrasound, myocardial sirius staining, serum CGRP and ET level.ResultsCompared to IR group(EF%=35.4±1.1，F(xiàn)S%=21.1±1.1), the rats in IT group (EF%=49.1±1.2，F(xiàn)S%=27.1±1.0) and IV1 group (EF%=46.3±2.2，F(xiàn)S%=26.6±0.6) showed better myocardial contraction (P<0.05) and reduced myocardial fibrosis (P<0.05).IT group and IV1 group also showed reduced ET but increased CGRP in the serum (P<0.05).There were no difference between IV2 group and IR group in both observation.ConclusionPretreatment with intrathecal injection of opium κ-receptor stimulant U50, 488H not only protected the myocardial function from myocardial ischemia/reperfusion injury, but also repressed myocardial fibrosis.The protection may result from modulation of CGRP and ET.

intrathecal injection; κ-opioid receptor; myocardial ischemia/reperfusion; calcitonin

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.11.009

寧波市自然科學(xué)基金(2012A610239)

林家燕，女，主治醫(yī)師，研究方向：器官保護與麻醉藥理，E-mail：ecaeme@163.com;曹豐，通信作者，女，教授，主任醫(yī)師，研究方向：冠心病，E-mail：17807929@qq.com。

Q95.3，R543.3，R364.1

A