王家清，于云龍，王慧星，劉華亭

(中國人民解放軍第一〇七醫(yī)院 神經(jīng)外科，山東 煙臺 264002)

microRNAs 224和21對人膠質(zhì)瘤干細胞存活的影響及相關(guān)的分子機制

王家清Δ，于云龍，王慧星，劉華亭

(中國人民解放軍第一〇七醫(yī)院 神經(jīng)外科，山東 煙臺 264002)

目的 探討microRNAs 224和21對人膠質(zhì)瘤干細胞存活的影響及相關(guān)的分子機制。方法 qPCR檢測惡性膠質(zhì)瘤樣品、人GBM干細胞、人工建立的GBM干細胞系和人體組織中microRNAs的失調(diào)表達情況。GBM神經(jīng)球干細胞系、GBM干細胞系(0822、0308和A172)、人工建立的細胞系U373及永生化人星形膠質(zhì)細胞分別轉(zhuǎn)染miR-21，miR-224模擬物或抑制劑，然后通過膜聯(lián)蛋白Ⅴ染色及Caspase 3/7活性檢測細胞凋亡，活細胞計數(shù)檢測細胞生長情況。利用TargetScan生物學(xué)軟件預(yù)測miR-21和miR-224的靶基因，并利用熒光素酶報告檢測microRNAs對Bim基因的靶向作用。Western blot檢測細胞轉(zhuǎn)染miR-21或 miR-224模擬物或抑制劑后對Caspase 3，Caspase 9及Bim蛋白表達的影響。結(jié)果 qPCR檢測結(jié)果表明，GSC、人腫瘤組織和GBM神經(jīng)球干細胞中，miR-21和miR-224顯著上調(diào)表達(P<0.05)。細胞凋亡和細胞生長檢測結(jié)果表明，miR-224和miR-21能調(diào)控GSC細胞凋亡和生長。靶基因預(yù)測分析Caspase 3，Caspase 9和Bim 3’-UTR序列為miR-224和miR-21潛在的靶基因，熒光素酶實驗進一步證實Caspase 3，Caspase 9和Bim 3’-UTR序列為miR-224和miR-21的直接靶點。進一步的實驗證明，miR-224和miR-21通過直接靶向Caspases和Bim調(diào)控細胞生長和凋亡。結(jié)論 上述結(jié)果表明miR-224和miR-21是GSC的凋亡抗性的重要生理驅(qū)動因子，其為膠質(zhì)瘤的治療提供了新的靶標(biāo)。

miR-224；miR-21；Caspase 3；Caspase 9；Bim；膠質(zhì)瘤干細胞；抗凋亡

多行性成膠質(zhì)細胞瘤(glioblastoma，GBM)是具有很強破壞性的腦部腫瘤，患者從確診到死亡的平均時間約為12～14個月[1]。患者在確診后，一般先通過外科手術(shù)切除腫瘤部位，再利用替莫唑胺進行化療和放療，這是目前治療多行性膠質(zhì)細胞瘤的標(biāo)準(zhǔn)方法[2]。然而，GBM在治療后短期內(nèi)總會復(fù)發(fā)。最近有研究表明，在人腦腫瘤中存在組織異質(zhì)性，并且越來越多的證據(jù)表明腫瘤形成，復(fù)發(fā)和其低存活率均與一群稱為膠質(zhì)瘤干細胞(glioma stem cells，GSCs)的具有化療和放療抗性的細胞有關(guān)[3-8]。

GBM被認(rèn)為源自神經(jīng)干細胞(NSCs)的轉(zhuǎn)化或成熟的有遺傳損傷的膠質(zhì)瘤細胞去的分化[9-10]。GSCs、神經(jīng)干細胞和神經(jīng)前體細胞(neural precursor cells,NPCs)具有一些類似的特征：能表達一些標(biāo)志分子，如CD133；并且具有自我更新、多潛能性和遷移能力[9-13]。CD133是一種能有效區(qū)分NSCs和GSCs的細胞分子標(biāo)記。CD133可能不是所有GSCs都具有的分子標(biāo)記，并且CD133作為細胞表面分子標(biāo)記表明膠質(zhì)瘤細胞具有干細胞樣細胞特性。研究表明，對于人原發(fā)性GBM，CD133是GSC的分子標(biāo)記[14-15]。

MicroRNAs(miRNAs)是小的非編碼調(diào)節(jié)RNA分子，其對許多生物學(xué)過程具有顯著的影響。最近研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可以作為腫瘤生長和存活的促進因子，因此比較惡性膠質(zhì)瘤和正常腦組織中miRNAs的相對表達量受到越來越多的關(guān)注[16-19]。NSCs中與神經(jīng)發(fā)育有關(guān)的miRNAs在GBM發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，并且70%已知的miRNAs在腦組織中均有表達[17]。經(jīng)過對GBM和其它癌癥中miRNAs的分析發(fā)現(xiàn)其具有致癌性，或通過諸如治療抗性，免疫逃避和失調(diào)表達等機制促進腫瘤生長。GBM中miRNAs的表達量通常比較高，如miR-21，miR-26a和miRs-221/222[20-24]。而GBM中研究的比較深入的致癌性miRNAs一般通過抑制腫瘤抑制因子的表達而促進癌癥發(fā)生，如miR-21通過靶向腫瘤抑制因子PTEN而促進癌癥的發(fā)生[16,19]。

GBM中能降低腫瘤生長和侵染并通常下調(diào)表達的那些miRNAs被稱為腫瘤抑制miRNAs。有研究表明，miR-7和miR-34a能抑制致癌基因EGFR，c-Met和Notch家族成員的表達[25-29]。盡管miRNA與腫瘤抑制功能有關(guān)，其重要的發(fā)揮作用的靶蛋白卻仍然未知，如miR-124和miR-137[30]。一些能促進或抑制GBM的miRNAs在其它癌癥中可能具有類似的致癌或腫瘤抑制特性[16,19]，盡管miRNA的致癌性已得到充分的研究，對miRNA靶向一些未知靶基因的研究仍然存在許多爭議[31-32]。miRNAs在一種GBM中失調(diào)表達，不代表其在另一種GBM中也失調(diào)表達，因此本研究集中探討與正常腦干細胞相比，在GBM干細胞中失調(diào)表達的那些miRNAs。本研究重點探討miR-21和miR-224抑制劑對細胞的影響，以期為臨床中膠質(zhì)瘤的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與組織：樣品來源于根據(jù)世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)為GBM類型的患者外科手術(shù)切除的組織。根據(jù)以前的報道，富含GSCs的人原發(fā)性GBM以0308，0822和1228命名[33]，進行相關(guān)實驗之前告訴患者并征得其同意。GBM干細胞系(0308，0822，1228)從Dr.Jeongwu Lee處獲得，并按以前所述的方法培養(yǎng)[27-28,33]。

1.1.2 主要試劑及儀器：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco(Gibco，美國)；鼠抗人caspase-3/9抗體、兔抗人BCL2L11抗體購自CST(Cell Signaling Technology，美國)；鼠抗人α-tubulin抗體購自Sigma(美國)；miRNAs及相應(yīng)的陰性對照購自銳博生物(中國)；miRNeasy and miScript RT kits(Qiagen，美國)；Agilent Site Directed Mutagenesis kit(Santa Clara，美國)；脂質(zhì)體2000購自Invitrogen(美國)；Caspase 3/7 Glo底物檢測溶液 (Promega，美國)；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所(中國)；PE-膜聯(lián)蛋白-Ⅴ凋亡染色試劑盒(BD Pharmingen，美國)；Glomax光度計、雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)(Promega，美國)；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)；miR-224模擬物，miR-224抑制劑，miR-21模擬物，miR-21抑制劑均購自RIBOBIO(中國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：GBM細胞系U373、A172和永生化星形膠質(zhì)細胞均購自ATCC，根據(jù)以前所描述的方法進行培養(yǎng)[25-26]。

1.2.2 qPCR檢測：qPCR檢測不同組織和細胞類型中miRNAs的表達水平。來自CD133+ NSCs和CD133+GBM干細胞樣品，根據(jù)說明書的要求利用miRNeasy and miScript RT kits提取樣品總RNA。反轉(zhuǎn)錄后，cDNA稀釋至終濃度為10 ng/ml，每個樣品使用50～100 ng的cDNA進行qPCR反應(yīng)。U6作為檢測時的內(nèi)參基因。

1.2.3 MicroRNAs，siRNAs與轉(zhuǎn)染：根據(jù)實驗?zāi)康模D(zhuǎn)染miRNA或miRNA抑制劑的細胞或鋪于細胞培養(yǎng)板中直接進行轉(zhuǎn)染，或經(jīng)多聚-L-鳥氨酸和層粘連蛋白處理以能夠貼壁，處理后第二天進行轉(zhuǎn)染。按照說明書的要求，用脂質(zhì)體2000進行轉(zhuǎn)染。

1.2.4 Western blot檢測：收集細胞樣品，加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，每個樣品取50 蛋白蛋白，加入2×SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水煮樣5 min使蛋白變性，SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。2.5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃輕搖過夜孵育(抗Caspase 3抗體，1:1000稀釋；抗Caspase 9抗體，1:1000稀釋；抗PARP抗體，1:1000稀釋；抗Bim抗體，1:2000稀釋；抗α-tubulin抗體，1:5000稀釋)，PBST洗膜3次后，加入HRP標(biāo)記的二抗(1:2000比例稀釋)，37 ℃孵育2 h。ECL法化學(xué)發(fā)光顯影檢測蛋白表達。α-tubulin作為蛋白上樣時的內(nèi)參蛋白。

1.2.5 細胞計數(shù)：通過細胞計數(shù)檢測轉(zhuǎn)染miRNA或miRNA抑制劑對細胞活性的影響。miRNA轉(zhuǎn)染后3～5天進行細胞計數(shù)。取10 μL細胞樣品利用細胞計數(shù)儀進行計數(shù)。

1.2.6 Caspase 3/7活性檢測：檢測caspase活性以評估轉(zhuǎn)染miRNAs或miRNA抑制劑后對細胞凋亡的影響。miRNA轉(zhuǎn)染后3～4 d，使用Caspase 3/7 Glo底物溶液檢測Caspase 3/7活性。雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性 (Promega)。使用Glomax光度計進行發(fā)光檢測。通過細胞數(shù)目和Bradford分析蛋白濃度從而對發(fā)光讀數(shù)進行校正。所得數(shù)值以RLU/細胞數(shù)每毫升表示。

1.2.7 細胞流式檢測細胞凋亡：使用雙染色流式檢測試劑盒檢測細胞凋亡比例。miRNA轉(zhuǎn)染后4～5 d，按照說明書的要求，使用PE-膜聯(lián)蛋白Ⅴ凋亡染色試劑盒進行染色，然后通過FACSCalibur分選陽性細胞，并用FlowJo軟件進行分析。

1.2.8 熒光素酶活性檢測：構(gòu)建Caspase 3-3’-UTR、Caspase 9-3’-UTR和BCL2L11熒光素酶報告質(zhì)粒，然后進行雙熒光素酶活性檢測以證實miRNAs的特異性靶位點。細胞按照如上所述的方法鋪板，轉(zhuǎn)染miRNA、相應(yīng)的報告質(zhì)粒及對照質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后48 h，使用雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。轉(zhuǎn)染了對照miRNA和空載體的細胞的熒光素酶活性作為對照。

1.2.9 3’-UTR突變：設(shè)計針對BCL211、CASPASE 3和CASPASE 9的突變引物，利用Agilent Site Directed Mutagenesis kit在miRNA結(jié)合的靶位點引入突變。將miR-21在BCL211和CASP3上的結(jié)合位點進行突變，miR-224在CASP3上的結(jié)合位點進行突變。引物序列如下：miR-582在CASP3結(jié)合位點F：5’-CCCCCCACTTAAGACTGTGTATTCTAGTTTTGTCAACGGCGGCAA-ATGA TGATGTGG-3’；R：5’-CCACATCATCATTTGCCGCCGTTGAC-AAAACTAGAAT ACACAGTCTTAAGTGGGGGG-3；野生型序列：5’-CCCCCCACTTAAGACTGT GTATTCTAGTTTTGTCAAACTGTAGA-AATATGTGTGG-3’。對于miR-21在BCL2L11上的結(jié)合位點：F： 5’ CTTATCAACTGAG CCAAATGTCTGTCGCGCCGGGTGTTT-CCTTTACCTTGTAAAATTTTG-3’, R: 5’-CAAAATTTTACAAGGTAA AGGAAACACCCGGCGCGACAGACA-TTTGGCTCAGTTGATAAG-3’；野生型序列：5’-CTTATCAACTGAGCCAAATGTCTGTGT-GCAATTGTGTTTCCTTTACC TTGTAAAATTTTG-3’。對于miR-21在CASP上的結(jié)合位點：F: 5’-A A A TT AG GAATAAATAA-AAATGGATACTGCGCGCCGCATTATGAGAGGCAATGTTGTT AA-3’, R: 5’-TTAACAACATTGCCTCTCATAATGCGGCGCGCAGTAT-CCATTT TTATTTATTCCTAATTT-3’，野生型序列：5’-AAATTAGGAATAAATAAAAATG GATACTGGTGCAGTCATTATG-AGAGGCAATGATTGTTAA-3’。

2 結(jié)果

2.1 GSC、人腫瘤組織和GBM神經(jīng)球干細胞中，miR-21和miR-224顯著上調(diào)表達 qPCR檢測CD133+NSCs和3個CD133+GSC樣品中miR-224和miR-21的表達情況。結(jié)果表明，與NSCs相比，3個GSC樣品中miR-224和miR-21均表現(xiàn)出顯著的差異化表達。由于它們的獨特性和潛在的致癌性，接下來的實驗中對miR-224和miR-21進行進一步分析，見圖1A和1B。為進一步明確miR-224和miR-21在正常組織和GBM組織中的表達情況，qPCR檢測了多個GBM和3個正常人組織樣品中miR-224和miR-21的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分GBM中miR-224表達量升高，見圖1C，但在3個GBM組織中，未檢測到miR-224，表明不是所有的GBM腫瘤能上調(diào)miR-224的表達。與正常腦組織相比，GBM中miR-21的表達量顯著升高，見圖1D。

接下來檢測了3種GBM干細胞系中miR-224和miR-21的表達情況見圖1E和F，這些細胞系用不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。在無血清條件下培養(yǎng)比在有血清條件下培養(yǎng)更接近原始的GBMs(0308，0822，和1228)。然后通過qPCR進一步檢測了在有血清條件下培養(yǎng)時，GBM細胞系A(chǔ)172、U373和永生化星形膠質(zhì)細胞中miR-224和miR-21的表達水平。所有的GSC樣品、絕大部分人GBM組織和GBM干細胞系中，miR-224和miR-21的表達量均顯著升高。

圖1 qPCR檢測miR-224和miR-21在GSCs中上調(diào)表達**P<0.01，***P<0.001，與對照組比較Fig.1 Real-time PCR verification of miR-224 and miR-21 up-regulation in ±s)**P<0.01, ***P<0.001, compared with control group

2.2 miR-224和miR-21調(diào)控GSC生長和凋亡 將miR-224和miR-21抑制劑轉(zhuǎn)染入GBM神經(jīng)球干細胞系中，并用含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，以證實它們的致癌潛力。轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后，GBM干細胞系(0822)及人工建立的細胞系U373的生長受到抑制，見圖2A。兩種GBM干細胞系(0822和0308)轉(zhuǎn)染miR-224抑制劑后，與對照組相比，細胞生長明顯被抑制，見圖2B，而用含血清培養(yǎng)的GBM細胞系A(chǔ)172及永生化人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)染miR-224后，生長的更快，見圖2C。永生化人星形膠質(zhì)細胞用miR-224抑制劑處理后，與對照組相比，其生長速度沒有變化，見圖2C。這些結(jié)果與miR-224和miR-21具有致癌性是一致的。miR-21抑制劑轉(zhuǎn)染的所有GBM干細胞系具有更高的Caspase 3/7活性，或膜聯(lián)蛋白Ⅴ/7-AAD表達量(圖2D)。miR-224抑制劑轉(zhuǎn)染的GBM干細胞系中，Caspase 3/7活性增加了1～2倍(見圖2E)。這些結(jié)果與miR-224和miR-21相關(guān)的抗凋亡機制是一致的。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-21和 anti-miR-224抑制劑引起細胞凋亡**P<0.01，***P< 0.001，與對照組比較Fig.2 Forced expression of anti-miR-21 and anti-miR-224 triggers ±s)**P<0.01, ***P<0.001, compared with control group

2.3 miR-224和miR-21通過直接靶向Caspase 3，Caspase 9和Bim 3’-UTR序列調(diào)控促凋亡基因的表達為證實miR-224和miR-21的生物學(xué)相關(guān)性，本研究分別探討了miR-224和miR-21可能的靶基因。根據(jù)TargetScan軟件預(yù)測結(jié)果，miR-21可能靶作用于Bim和Caspase 3，miR-224可能靶向Caspase 3和Caspase 9，見圖3A。另外，圖3A也顯示了突變實驗中的突變堿基位點(紅色)。Western blot結(jié)果表明，miR-224轉(zhuǎn)染的GBM細胞系U373、A172和星形膠質(zhì)細胞系中，Caspase 3和Caspase 9的表達量降低，見圖3B。和上述結(jié)果相一致，0882 GBM干細胞系轉(zhuǎn)染miR-224抑制劑后，與對照組相比，Caspase 3和Caspase 9表達量增加，見圖3B。GBM細胞系轉(zhuǎn)染miR-21模擬物后，Bim和Caspase 3蛋白表達量降低，而轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后， Bim和

Caspase 3表達量增加，見圖3C。轉(zhuǎn)染了miR抑制劑后，靶蛋白的表達量升高表明這些miRs是Caspase 3和Bim的潛在的生理調(diào)節(jié)因子。qPCR檢測結(jié)果證實Caspase 3和Caspase 9的mRNA表達對miR-224很敏感。本研究結(jié)果也表明，1228和A172兩種細胞系過表達miR-21后，PARP的剪切減弱，而這是細胞凋亡活性下降的標(biāo)志，見圖3D。熒光素酶活性檢測結(jié)果表明，miR-224、miR-21和預(yù)測的基因靶位點有特異性相互作用 見圖3E和F，即miR-224靶向CASP3和CASP9，miR-21靶向BIM和CASP3，見圖3G和H。突變3’UTR區(qū)域的miRNAs結(jié)合位點后，與野生型質(zhì)粒相比，miRNAs部分增強了熒光素酶活性，見圖3I。這些數(shù)據(jù)表明，腫瘤干細胞表達的miRNAs有效下調(diào)了凋亡信號通路中至關(guān)重要蛋白的表達。

圖3 miR-224 和miR-21靶向作用于Bim和*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與對照組比較Fig.*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, compared with control group

2.4 Caspases和Bim分別是miR-224和miR-21的靶基因 本研究使用同時敲低Caspase和Bim表達并轉(zhuǎn)染miR-224和miR-21抑制劑的方法探討miR-224和miR-21分別靶向Caspase和Bim對細胞數(shù)量的影響。siRNA沉默Bim表達后，miR-21抑制劑不能抑制細胞的生長，見圖4A。并且siRNA沉默Bim表達后，miR-21抑制劑不能引起B(yǎng)im表達增加，見圖4B。使用miR-224抑制劑和Caspase的siRNA共處理細胞后得到了類似的結(jié)果。Western blot結(jié)果顯示，針對Caspase的特異性siRNA能有效的敲低細胞中Caspase 3的表達，見圖4B和4C。而且，利用pan-Caspase抑制劑ZVAD和miR-224抑制劑共同處理GSCs細胞部分逆轉(zhuǎn)了Caspase抑制劑所導(dǎo)致的細胞數(shù)量下降，見圖4D。

圖4 Caspase 3和Bim是miR-224和miR-21的靶位點*P<0.05，***P<0.01，***P<0.001，與對照組比較Fig.4 Caspase 3 and Bim as critical targets of miR-224 and ±s)*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, compared with control group

3 討論

由于GSCs的形成和調(diào)控機制仍然未知，研究miRNAs的功能和其治療潛力是至關(guān)重要的。一些研究表明，miRNAs的能調(diào)控GSCs[25,27,29,36-37]。本研究探討了兩個獨特的抗凋亡miRs，miR-21和miR-224的生物學(xué)功能。有研究已經(jīng)證明，miR-224在垂體瘤中過表達，并預(yù)測其靶向Smad3，但在其它方面的作用沒有相關(guān)報道。目前尚無關(guān)于miR-21在癌癥中作用的相關(guān)報道，據(jù)信其位于致腫瘤miRNA群內(nèi)[34-35]。研究表明miR-21和miR-224在許多人的GSCs和GBM腫瘤組織中過度表達。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-21和miR-224直接靶向凋亡mRNAs Caspase 3、Caspase 9和Bim。miR-21和miR-224作為致癌因子發(fā)揮功能，使得永生化星形膠質(zhì)細胞和GBM細胞系生長速度加快，而miR-21和miR-224抑制劑導(dǎo)致凋亡細胞死亡并抑制GBM干細胞數(shù)量下降。通過敲低Bim和Caspase3表達逆轉(zhuǎn)了miR-21和miR-224抑制劑的效應(yīng)，表明它們在癌癥中是致癌miRs的重要靶標(biāo)。

盡管對癌癥干細胞假說的了解越來越深入，miRNAs在癌癥干細胞中的作用卻少有研究。相當(dāng)數(shù)量的miRNAs可能在癌癥干細胞中發(fā)揮重要作用，本研究集中探討了兩種能保護細胞免于凋亡的miRNAs。干細胞的自我更新和增殖部分是由誘導(dǎo)凋亡所調(diào)控的。因此，干細胞的數(shù)量是那些敗給分化/凋亡和那些通過增殖新生成的細胞平衡的結(jié)果。干細胞凋亡調(diào)控失調(diào)被認(rèn)為是一些癌癥的病理學(xué)基礎(chǔ)，這些癌癥部位的凋亡抗性導(dǎo)致腫瘤不受控制持續(xù)生長[38]。

Bcl-2和Caspase家族成員在細胞凋亡中扮演主要角色。眾所周知Caspase剪切通路起始于Caspase被固有或外部途徑活化。Caspase 9是固有活化途徑起始因子，伴隨細胞色素c的釋放，其在線粒體膜上被激活；Caspase3是介導(dǎo)許多細胞蛋白切割的因子[39]。miR-224在下調(diào)兩種caspase通路成分表達中的作用很明顯是抗凋亡的。

Bcl-2家族包括數(shù)量眾多的結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白，這些蛋白能通過控制線粒體膜通透性并結(jié)合細胞色素c的釋放調(diào)控固有凋亡途徑。促凋亡蛋白BCL2L11 (Bim)通過結(jié)合于Bcl-2家族的抗凋亡成員，包括Bcl-xl和Mcl-1，或通過激活促凋亡成員Bax和Bak而調(diào)控細胞凋亡[40-41]。本研究結(jié)果表明miR-21能調(diào)節(jié)Bim表達，從而抑制GBM干細胞凋亡，增強Bcl-2表達，并減少PARP剪切。而且，miR-21也直接靶向Caspase3以增強對GSCs中凋亡抑制的影響。miR-224靶向凋亡起始因子Caspase9和效應(yīng)器Caspase3，于是阻斷了固有凋亡途徑。

本研究證明，在這些獨特的miRNAs存在的條件下，上調(diào)凋亡途徑靶向蛋白表達對于增加凋亡活性是足夠的。而特異性上調(diào)Caspase3全長表達已經(jīng)被證明能使T細胞對凋亡更敏感[42]，而在miRNA調(diào)控或癌癥背景下，Caspase3表達對凋亡的影響尚沒有相關(guān)報道。Bim通常會被細胞分裂素如ERK下調(diào)，而FOXO3a的表達能誘導(dǎo)Bim表達，但在miR抑制劑處理后通過增加Bim表達誘導(dǎo)凋亡以前尚未見相關(guān)報道。

許多GSCs樣品中，miR-21和miR-224強烈上調(diào)表達，并且兩者共同靶向固有凋亡途徑中的相關(guān)成分，表明GSCs對線粒體膜不穩(wěn)定和凋亡很敏感。GSCs可能通過增加這些miRNAs的表達而逃避凋亡。目前，一些抗腫瘤治療能利用毒性分子的抗體遞呈效應(yīng)誘導(dǎo)癌細胞凋亡，抗體結(jié)合于諸如TRAIL之類的死亡受體上，然后誘導(dǎo)細胞凋亡，或通過抑制組蛋白乙?；鸺毎蛲鯷43-45]。GBM中，腫瘤的起始和發(fā)育似乎是通過凋亡失調(diào)實現(xiàn)的；有報道已經(jīng)證明造血干細胞中凋亡失調(diào)能導(dǎo)致細胞分化缺陷并增加患癌風(fēng)險[46]。本研究結(jié)果揭示了一種獨特的抑制腫瘤生長的方法，即利用抗凋亡致癌miRNAs miR-224和miR-21的拮抗劑抑制腫瘤生長。隨著治療腦部腫瘤的局部導(dǎo)入siRNAs和miRNAs的技術(shù)日趨完善，miR-224和miR-21的拮抗劑可以作為有效的導(dǎo)入載荷。本研究證明miR-224和miR-21是GSCs凋亡抗性重要的生理驅(qū)動因子，其為腫瘤的治療提供了新的靶標(biāo)。

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(編校：師維康)

Effect of microRNAs 224 and 21 on human glioblastoma stem cell survival and the possible molecular mechanisms

WANG Jia-qingΔ, YU Yun-long, WANG Hui-xing, LIU Hua-ting

(Department of Neurosurgery, The People ’s Liberation Army 107 Hospital, Yantai 264002, China)

ObjectiveTo explore the effect of microRNAs 224 and 21 on human glioma stem cells survival and the possible molecular mechanisms.MethodsqPCR was used to detect the dysregulated expression of microRNAs in malignant glioma samples, human GBM stem cells, artificially established GBM stem cell lines and human tissues.Caspase 3/7 assay, Annexin V apoptosis/fluorescence assay were performed to determine the effect of miR-21 or miR-224 mimics and inhibitor on cell apoptosis.Living cells count was used to assess miR-21 or miR-224 mimics and inhibitor on cell growth.TargetScan was used to explore potential targets of miR-21 and miR-224, and dual luciferase reporter assay was used to identify whether the 3’UTR of Caspase 3, Caspase 9 and Bim mRNA was a binding target of miR-21 or miR-224.Western blot was used to detect the expression of Caspase 3, Caspase 9 and Bim protein after transfection of miR-21 or miR-224 mimics or inhibitors.ResultsmiR-21 and miR-224 are strongly upregulated in GSC samples, multiple GBM human tumor specimens, and GBM neurosphere stem cell lines(P<0.05).Caspase 3/7 assay and Annexin V apoptosis/fluorescence assay results showed that miR-224 and miR-21 regulated GSC apoptosis.Living cells count results demonstrated that miR-224 and miR-21 regulated GSC growth.miR-224 and miR-21 regulate pro-apoptotic gene expression by directly targeting Caspase 3, Caspase 9, and Bim 3’-UTRs.ConclusionThese results indicate that miR-224 and miR-21 are important physiologic drivers of GSC resistance to apoptosis, providing new points of therapeutic leverage against these treatment-resistant cells.

miR-224; miR-21; Caspase 3; Caspase 9; Bim; gloima stem cell; anti-apoptotic

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.11.008

王家清，通信作者，男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：腦膠質(zhì)瘤的診治，E-mail：w107wjq@163.com。

R739.41

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