侯重文，朱梓昂，張金華，張?zhí)鞁?，劉飛Δ，凌沛學

(1.山東省藥學科學院 山東省生物藥物重點實驗室 山東省多糖類藥物工程實驗室 多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實驗室，山東 濟南 250101；2.山東福瑞達醫(yī)藥集團公司，山東 濟南 250101；3.華東理工大學 生物工程學院，上海 200237)

高效凝膠色譜法測定貽貝多糖含量及分子量

侯重文1,2，朱梓昂3，張金華1,2，張?zhí)鞁?,2，劉飛1,2Δ，凌沛學1,2

(1.山東省藥學科學院 山東省生物藥物重點實驗室 山東省多糖類藥物工程實驗室 多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實驗室，山東 濟南 250101；2.山東福瑞達醫(yī)藥集團公司，山東 濟南 250101；3.華東理工大學 生物工程學院，上海 200237)

目的 建立使用凝膠色譜測定貽貝多糖含量和分子量的方法。方法 使用島津高效液相色譜，TSK-gel GMPWXL(7.8 mm×300 mm)凝膠色譜柱，以0.05 mol/mL硝酸鈉溶液(含0.05%疊氮鈉)做為流動相，柱溫35 ℃，流速為0.6 mL/min，RID-20AT示差折光檢測器，檢測池溫40 ℃。結果 對所建立的分析方法進行精密度、穩(wěn)定性、重復性以及回收率等方法學研究。經(jīng)測定厚殼貽貝多糖平均含量88.6%，平均重均分子量為1 261 411；紫貽貝多糖平均含量87.4%，平均重均分子量為1 244 062。結論 本文所用方法各項指標均符合分析要求，且具有快速可靠、靈敏度高和重現(xiàn)性好等特點，可用于貽貝多糖的質(zhì)量控制。

凝膠色譜法；貽貝多糖；含量測定；分子量測定

貽貝(Mussel)，俗稱青口、海紅、淡菜，是海洋貝類養(yǎng)殖中的重要種類，在我國沿海以山東、遼寧、浙江、廣東等地養(yǎng)殖規(guī)模較大，品種主要有紫貽貝(Mytilusedulis)、厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)和翡翠貽貝等，其中紫貽貝和厚殼貽貝是我國貽貝的主要養(yǎng)殖種類[1-2]。貽貝營養(yǎng)價值很高，自古就被認為具有補肝腎、降血脂、治療高血壓等功效，是傳統(tǒng)的滋補食品，有“海中雞蛋”的美譽[2-8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)貽貝降血脂功能主要源自于體內(nèi)的多糖，遂用煮沸浸提、醇沉、層析等技術對厚殼貽貝肉和紫貽貝肉進行了分離純化，最終分別獲得成分單一的貽貝多糖組分。

多糖的性質(zhì)和藥理作用與其分子量大小、分子量分布及其結構密切相關[9]。TSK-gel PW系列凝膠柱填料為親水的球形多孔高聚物，常被用于分離多糖、多肽、水溶性有機聚合物和其他水溶性大分子樣品[10-12]。其中GMPWXL型凝膠色譜柱在分析分子量范圍在5×102～1×107葡聚糖時具有良好的線性。本研究旨在將該色譜柱用于凝膠色譜法測定貽貝多糖的含量及分子量，確保其分析結果準確有效，從而為其結構分析、質(zhì)量控制提供理論依據(jù)，為貽貝多糖在醫(yī)藥和保健品領域的開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品：厚殼貽貝干、紫貽貝肉干購自浙江嵊泗縣華利水產(chǎn)有限公司；貽貝多糖樣品：自制。

1.1.2 色譜柱和對照品：色譜柱：TSK-gel GMPWXL(7.8 mm×300 mm凝膠色譜柱，日本TOSOH公司生產(chǎn)，購自北京綠百草公司；Dexrtan系列進口右旋糖酐對照品：DXT180、DXT55K、DXT102K、DXT300K、DXT530K、DXT1185K、DXT2990K，重均分子量分別為180、55 500、102 000、291 600、534 000、1 185 000、2 990 000，購自American polymer standards corp.。

1.1.3 試劑：硝酸鈉、疊氮鈉、氯化鈉均為分析純，乙醇為食品級，純化水為娃哈哈純凈水；DEAE-纖維素，購自美國GE公司；堿性蛋白酶2709，購自東華強盛生物技術公司。

1.1.4 儀器：島津LC-20AT高效液相色譜儀；RID-20AT示差折光檢測器：島津液相色譜工作站。

1.2 方法

1.2.1 貽貝多糖的純化制備：將厚殼貽貝干粉碎成粗粉，按比例與水混合進行攪拌蒸煮；待肉渣沉降后除去廢渣；濾液使用酶法除蛋白；加入1.5倍體積的95%食品級乙醇沉淀出粗多糖。粗多糖重溶后離心取上清，進行DEAE-纖維素層析，收集0.05 mol/mL氯化鈉溶液洗脫組分，經(jīng)透析濃縮后冷凍干燥得到白色的厚殼貽貝多糖粉末。紫貽貝干處理方式同上，同樣得到白色的紫貽貝多糖粉末。

1.2.2 溶液配制

① 對照品溶液制備：精密稱取干燥至恒重的右旋糖酐系列標準品各10 mg，分置2 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL溶液中含各右旋糖酐對照品5 mg)。經(jīng)0.22 μm濾膜濾過后備用。

② 供試品溶液制備：分別稱取2種貽貝多糖粉末適量，稱定，加流動相制成每1 mL中約含5 mg的溶液，振蕩混勻，室溫放置過夜，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過后作為供試品溶液備用。

1.2.3 色譜條件:采用檢測多糖專用凝膠色譜柱，TSK-gel GMPWXL；柱溫為35 ℃；流動相：0.05 mol/mL硝酸鈉溶液(含0.05%疊氮鈉)；流速為0.6 mL/min；示差檢測器溫度為40 ℃；島津GPC分析軟件。

1.2.4 分子量標準曲線的建立:取右旋糖酐標準品DXT180、DXT55K、DXT102K、DXT300K、DXT530K、DXT1185K、DXT2990K溶液，分別精密移取20 μL注入高效液相色譜儀，記錄保留時間。以分子量的對數(shù)值為縱坐標，以相應色譜峰的保留時間為橫坐標，使用GPC軟件擬合得到分子量校正曲線。

1.2.5 含量標準曲線的建立:取真空干燥至恒重的DXT1185K右旋糖酐標準品0.265 g，精密稱定，置入 25 mL量瓶中，加入流動相溶解，定容至刻度，配置成濃度10.6 mg/mL的對照品儲備液。精密移取儲備液0.5、1、2、3、4、5 mL于5 mL容量瓶中，分別加流動相溶液稀釋至刻度，依次共得6份不同濃度對照品溶液，分別精密移取各20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標，對照品溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.6 系統(tǒng)適應性考察

① 精密度試驗：取DXT1185K右旋糖酐標準品溶液，按1.2.3色譜條件，重復進樣6次，進樣量20 μL，記錄峰面積變化并根據(jù)GPC軟件計算得到重均分子量變化來考察儀器精密度。

② 重復性試驗：精密稱取貽貝多糖樣品6份，制得供試品溶液，按1.2.3色譜條件測得的貽貝多糖樣品主峰的含量及重均分子量。

③ 穩(wěn)定性試驗：取適量貽貝多糖供試品溶液，分別放置0、1、2、6、9、12、18、24 h，按1.2.3色譜條件依次記錄色譜圖，測得多糖含量及重均分子量。

④ 加樣回收率試驗：精密稱取DXT1185K右旋糖酐標準品252 mg，置50 mL量瓶中，加流動相溶解定容至刻度，得濃度5.04 mg/mL的儲備液。精密稱取6份已知含量貽貝多糖樣品各約25 mg，分置于10 mL量瓶中。精密移取6份對照品儲備液5 mL，加入6份樣品中，再用流動相溶解并定容至刻度，搖勻，用0.22 μm濾膜濾過后按色譜條件測定多糖含量，計算回收率。

1.2.7 貽貝多糖樣品含量及分子量的測定：分別稱取3批2種貽貝多糖樣品各125 mg，置于25 mL容量瓶中，用流動相定容。按1.2.3色譜條件分別移取20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，以右旋糖酐DXT1185K做為標準品計算多糖含量、并使用GPC軟件分析多糖分子量及分子量分布情況。

2 結果

2.1 分子量檢測標準曲線的建立 右旋糖酐系列標準品保留時間見表1，使用GPC軟件計算得到三次回歸方程，其相關系數(shù)達0.999 2，具有良好的線性關系。

表1 右旋糖酐分子量校正曲線數(shù)據(jù)表Tab.1 Regression curve of Dextrans standard substances

圖1 分子量檢測標準曲線Fig.1 Calibration curves of Dextrans

2.2 多糖含量測定標準曲線 由于保留時間相近，采用DXT1185K右旋糖酐作為標準品測定貽貝多糖的含量。由圖2得到線性回歸方程：y=22873x-18374，R2=0.9999，說明在該范圍內(nèi)線性關系良好。

圖2 DXT1185K標準曲線Fig.2 Calibration curve of DXT1185K

2.3 精密度試驗 DXT1185K標準品峰面積分別為1 321 129、1 319 009、1 319 641、1 317 782、1 314 209、1 316 317，平均值為1 318 015，RSD=0.188%；根據(jù)GPC軟件計算得到重均分子量分別為1 219 815、1 213 949、1 205 778、1 204 568、1 201 472、1 202 538，平均值為1 208 020，RSD=0.60%，說明儀器精密度良好。

2.4 重復性試驗 厚殼貽貝多糖樣品峰面積分別為1 088 606、1 085 059、1 083 493、1 081 114、1 079 032、1 077 086，平均值為1 082 398，RSD=0.388%；根據(jù)GPC軟件計算得到重均分子量分別為1 271 294、1 273 168、1 270 181、1 269 722、1 271 659、1 270 052，平均值為1 271 012，RSD=0.102%，說明儀器重現(xiàn)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗 根據(jù)GPC軟件測得24 h內(nèi)峰面積RSD=0.54%，重均分子量RSD=0.524%，說明儀器穩(wěn)定性良好。見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗結果Tab.2 Results of stability test

2.6 加樣回收率 由表3結果可知，平均回收率為96.70%，RSD=1.32%，說明加樣回收率較好，達到分析要求。

表3 加樣回收率試驗結果Tab.3 Results of recovery test

2.7 樣品分析 厚殼貽貝多糖與紫貽貝多糖凝膠色譜圖見圖3。

圖3 厚殼貽貝多糖(A)與紫貽貝多糖(B)凝膠色譜檢測圖Fig.3 HPLC chromatograms of the polysaccharide of Mytilus coruscus(A)and Mytilus edulis (B)

以右旋糖酐DXT1185K為標準品，計算得到3批次厚殼貽貝多糖平均含量88.6%，平均重均分子量為1 261 411；3批次紫貽貝多糖平均含量87.4%，平均重均分子量為1 244 062。見表4。

表4 貽貝多糖供試品含量及分子量測定結果Tab.4 Content and Molecular weight test results of the sample

3 討論

在使用凝膠色譜法分析多糖分子量時常以鹽溶液作為流動相，可以防止因糖鏈過度伸展而造成的多糖分子量檢測值過大。本文在研究過程中參考相關文獻，先后嘗試使用了硫酸鈉[10,13-14]、硝酸鈉[15]、磷酸鈉、乙酸鈉[16]以及磷酸二氫鉀[17]等鹽溶液，通過比對保留時間、峰型等指標，最終選用了0.05 mol/mL硝酸鈉溶液作為檢測流動相。

但在測定貽貝多糖分子量時，由于實驗條件所限，選用的是Dextran系列右旋糖酐標準品建立分子量校正曲線。同時選取了保留時間最為接近的DXT1185K作為標準品計算多糖含量。但根據(jù)分別對2種貽貝多糖分子結構的初步測定，均為含有支鏈的α-吡喃型葡聚糖，以Dextran系列作為標準品可能存在一定誤差，而且計算出的多糖分子量也分布較寬。

綜上所述，本研究通過煮沸浸提、醇沉、層析等技術，分別從厚殼貽貝和紫貽貝中分離獲得結構相對單一物質(zhì)貽貝多糖，并使用凝膠色譜法對其含量和相對分子質(zhì)量進行了測定。根據(jù)對測定方法的精密度、重復性、穩(wěn)定性以及回收率等指標進行研究，證明了該測定方法不但各項指標均符合分析要求，還具有快速簡單、靈敏度高和重現(xiàn)性好等特點。使用該方法分別對2種貽貝多糖的3批樣品進行了檢測，結果顯示2種貽貝多糖在含量以及重均分子量上區(qū)別不大，厚殼貽貝多糖分子量略大于紫貽貝多糖。為下一步對2種貽貝多糖的分子結構解析和藥理作用分析等工作提供了理論依據(jù)，并為其在醫(yī)藥和保健品領域的開發(fā)提供了質(zhì)量控制標準。

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(編校：吳茜)

Determination of the content and the molecular weight of Mussel Polysaccharide by GPC

HOU Zhong-wen1,2, ZHU Zi-ang3, ZHANG Jin-hua1,2, ZHANG Tian-jiao1,2, LIU Fei1,2Δ, LING Pei-xue1,2

(1.Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences, Key Laboratory of Biopharmaceuticals, Engineering Laboratory of Polysaccharide Drugs, National-Local Joint Engineering Laboratory of Polysaccharide Drugs, Ji’nan 250101, China; 2.Shandong Freda Pharmaceutical Group Company, Ji’nan 250101, China; 3.School of Biotechnology, East China University of Science and Technology,Shanghai 200237, China)

ObjectiveTo develop a gel permeation chromatography method for determination of content and molecular weight (Mw) of Mussel Polysaccharide.MethodsUsing GPC method, the sample was separated with TSK-gel GMPWXL(7.8 mm×300 mm) chromatography column which was set at 35 ℃.The mobile phase was 0.05 mol/mL NaNO3(including 0.05%Na2N3) and the flow rate was 0.6 mL/min.The detector was RID-20AT.ResultsThe average molecular weight of the polysaccharide ofMytiluscoruscuswas 1 261 411 and the average content was 88.6%by using of the calibration curves of dextrans.The average molecular weight of the polysaccharide ofMytiluseduliswas 1 244 062 and the average content was 87.4%.ConclusionThe method established in this paper is simple and rapid, accurate and reproducible, which can be used for the quality control of Mussel Polysaccharide.

GPC; Mussel Polysaccharide; content determination; molecular weight determination

國家高技術研究發(fā)展(863)計劃(2014AA093603)；山東省科技發(fā)展計劃(2014GSF121043)；山東省自主創(chuàng)新成果轉(zhuǎn)化專項(2014CGZH1306)；山東省重點研發(fā)計劃(2015GSF121003)；濟南市重大專項(201403009)

侯重文，男，碩士，助理研究員，研究方向：微生物與生化藥學，E-mail：hzw0316@163.com；劉飛，通信作者，男，碩士，助理研究員，研究方向：生物技術，E-mail：lfshwu@163.com。

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.11.003

Q786

A