劉恒，葉麗平

(1.錦州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001；2.遼河油田總醫(yī)院渤海院區(qū) 腫瘤診治中心，遼寧 盤錦 124010)

SIRT1對(duì)卵巢癌CAOV3細(xì)胞增殖的影響及可能機(jī)制

劉恒1,2，葉麗平1Δ

(1.錦州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001；2.遼河油田總醫(yī)院渤海院區(qū) 腫瘤診治中心，遼寧 盤錦 124010)

目的 分析沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1)對(duì)人卵巢癌CAOV3細(xì)胞增殖的影響，并探討可能的作用機(jī)制。方法 利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的卵巢癌CAOV3細(xì)胞，分為正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組和SIRT1-siRNA轉(zhuǎn)染組。RT-PCR和Western blot檢測(cè)SIRT1的mRNA和蛋白表達(dá)水平；MTT檢測(cè)RNA干擾SIRT1后24、48、72h CAOV3細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RNA干擾SIRT1后CAOV3細(xì)胞周期分布；Western blot檢測(cè)RNA干擾SIRT1后CAOV3細(xì)胞SIRT1、p53、p21蛋白表達(dá)水平和p53乙?；癄顟B(tài)；免疫共沉淀檢測(cè)SIRT1蛋白和p53蛋白的相互作用。結(jié)果 與陰性對(duì)照組相比，SIRT1-siRNA轉(zhuǎn)染組72 h后SIRT1的mRNA和蛋白表達(dá)水平減少(P<0.05)；SIRT1-siRNA轉(zhuǎn)染組48、72 h后的細(xì)胞增殖率明顯降低(P<0.01)；SIRT1-siRNA轉(zhuǎn)染組S期細(xì)胞在細(xì)胞周期中所占比例顯著減少(P<0.01)，G1期細(xì)胞則明顯增加(P<0.01)；SIRT1-siRNA轉(zhuǎn)染組p53和p21蛋白表達(dá)水平顯著升高，p53處于高乙?；癄顟B(tài)(P<0.01)；在卵巢癌CAOV3細(xì)胞中SIRT1蛋白與p53蛋白存在相互作用。結(jié)論 通過特異性干涉SIRT1的表達(dá)能夠抑制卵巢癌CAOV3細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能為RNA干擾下調(diào)SIRT1的表達(dá)后，p53蛋白處于高乙?；癄顟B(tài)，繼而增強(qiáng)了p53蛋白依賴的p21蛋白的轉(zhuǎn)錄激活，從而阻滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖。

SIRT1；RNA干擾；卵巢癌；CAOV3；p53；p21

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1)是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，屬于sirtuin家族，為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性的組蛋白去乙酰化酶[1]。SIRT1 參與體內(nèi)多種重要的生理病理過程，在急性髓細(xì)胞白血病、前列腺癌、骨癌、宮頸癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤中，內(nèi)源性SIRT1的表達(dá)明顯高于正常組織，SIRT1在腫瘤發(fā)生過程中可能起到癌基因的作用[2-4]。另一方面，SIRT1在胃癌、惡性膠質(zhì)瘤、膀胱癌中表達(dá)下調(diào)，提示SIRT1可能起到抑癌基因的作用[5-6]。因此，SIRT1在各種腫瘤組織中呈現(xiàn)異質(zhì)性表達(dá)，通過多種調(diào)控機(jī)制發(fā)揮作用。例如SIRT1與Wnt和Notch等多種信號(hào)通路中的NF-κB、c-Myc、p53等蛋白存在相互作用，共同參與細(xì)胞周期的調(diào)控、參與炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡等，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)基因的調(diào)控作用[7-8]。SIRT1在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中扮演什么樣的角色并不明確。

有研究表明SIRT1在惡性卵巢癌組織中的表達(dá)水平明顯高于良性腫瘤組織[9]，但SIRT1在卵巢癌細(xì)胞中的作用還未見報(bào)道。SIRT1在卵巢癌的組織和細(xì)胞水平上表型是否一致？本研究旨在通過在卵巢癌CAOV3細(xì)胞株中特異性干涉SIRT1的表達(dá)，探討下調(diào)SIRT1表達(dá)對(duì)人卵巢癌CAOV3細(xì)胞增殖的影響，通過檢測(cè)SIRT1蛋白和p53蛋白之間是否存在相互作用，研究SIRT1在卵巢癌CAOV3細(xì)胞中的作用機(jī)制，為RNA干擾治療卵巢癌提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人卵巢癌細(xì)胞株CAOV3購于齊氏生物科技有限公司。

1.1.2 試劑：Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；SIRT1 siRNA(上海吉瑪公司)；DMEM/F12培養(yǎng)液(Hyclone公司)；SIRT1和p53抗體(Santa cruz公司)；p21抗體和Ac-p53 (lys382) 抗體(Cell signal公司)；GAPDH抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔，抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Protein A Sepharose TM CL-4B(AB公司)；MTT、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(北京碧云天生物技術(shù)公司)。

1.1.3 儀器：CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)；PCR擴(kuò)增儀(Mastercycler nexus X2，Eppendorf公司)；流式細(xì)胞儀(XL/XL-MCL,貝克曼庫爾特有限公司)；水浴式電轉(zhuǎn)印槽、電泳儀(Bio-Rad，美國(guó))；IBOX-600全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(UVP，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：CAOV3細(xì)胞培養(yǎng)條件為DMEM/F12培養(yǎng)基、10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素、飽和濕度、37 ℃和5%CO2。

1.2.2 SIRT1 siRNA的合成和轉(zhuǎn)染：針對(duì)人SIRT1的mRNA序列(GenBank No.NM_012238)設(shè)計(jì)特異的SIRT1 siRNA序列：正義鏈5’-GAAGUUGACCUCCUCAUUGUdTdT-3’，反義鏈 5’-ACAAUGAGGAGGUCAACUUCdTdT-3’[10]，陰性對(duì)照序列：正義鏈5’-CUUACGCUGAGUACUUUCGA-3’，反義鏈 5’-UCGAAAGUAC-UCAGCGUAAG-3’由上海吉瑪公司純化合成。卵巢癌CAOV3細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分為正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組和SIRT1-siRNA轉(zhuǎn)染組，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染，按照說明書進(jìn)行。

1.2.3 RT-PCR方法檢測(cè)SIRT1的mRNA表達(dá)水平:利用Trizol提取各組CAOV3細(xì)胞總RNA，并測(cè)定RNA濃度。按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR。SIRT1引物為F：5’-TGGCACA-GATCCTCGAACAA-3’和R：5’-TTTGGATTCCC-GCAACCTGT-3’，預(yù)期片段長(zhǎng)度為491bp；GAPDH引物為F：5’-CGGAGTCA-ACGGATTTGGTCGTAT-3’，5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，預(yù)期片段長(zhǎng)度為306 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并拍照。Image J軟件進(jìn)行灰度值分析?；騧RNA表達(dá)水平以每一樣品與其內(nèi)參GAPDH灰度比值表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 MTT法檢測(cè)CAOV3細(xì)胞生長(zhǎng)增殖:將各組轉(zhuǎn)染CAOV3細(xì)胞消化離心，以5×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，完全培養(yǎng)基總量為200 μL。每組細(xì)胞設(shè)6個(gè)復(fù)孔，檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為24、48、72 h；每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；各孔加入150 μL DMSO，搖床上低速慢搖15 min；酶標(biāo)儀上A490nm處測(cè)定每孔的A值；根據(jù)A值的大小來計(jì)算增殖率。公式如下：細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組A值/陰性對(duì)照組A值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期:將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAOV3細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，24 h后細(xì)胞數(shù)達(dá)到孔底面積80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后用胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，離心5 min，加1 mL 4 ℃預(yù)冷的70%冷乙醇固定，4 ℃過夜。離心，加入250 μg/mL的RNase A，4 ℃孵育30 min，向細(xì)胞懸液中加入50 μL PI，4 ℃避光孵育30 min；流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá):取各組細(xì)胞，加蛋白裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，并測(cè)定蛋白濃度。加入5×SDS樣品緩沖液，100 ℃煮沸5 min，離心后上樣，10%SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS(pH 7.4)封閉濾膜2 h，再分別與anti-SIRT1抗體(稀釋比為1:500)、anti-Ac-p53 (lys382)抗體(稀釋比為1:500)、anti-p53抗體(稀釋比為1:500)、anti-p21抗體(稀釋比為1:1000)和anti-GAPDH(稀釋比為1:1000)，4 ℃溫育過夜。TTBS洗滌3次后，HRP偶聯(lián)的IgG(稀釋比為1:5000)室溫溫育2 h，搖床上10 min洗膜3次，ECL發(fā)光法顯色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 免疫共沉淀檢測(cè)SIRT1和p53之間相互作用:CAOV3細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，5×含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。將細(xì)胞12，000 g離心25 min；取上清定量蛋白，取等量蛋白沉淀；在EP管中加入20 μL裂解液和5 μL 5×SDS上樣緩沖液，煮沸，-20 ℃保存留作上樣。取20 μL預(yù)冷混懸的蛋白A/G瓊脂糖珠子和2 μL與免疫沉淀時(shí)使用的抗體同種屬的普通IgG(normal IgG)，加入細(xì)胞上清液中，離心30 min。取上清，分出50 μL留存，補(bǔ)足體積至0.5 mL，加入4 μL p53抗體，孵育3 h后加入50 μL蛋白A/G瓊脂糖珠子繼續(xù)孵育2 h；離心棄上清；剩余的瓊脂糖珠子用PBS清洗，離心3 min。如上，反復(fù)洗5次，以上操作均在4 ℃條件下進(jìn)行。最后一次離心之后，加20 μL 2×SDS上樣緩沖液，煮沸5 min，蛋白變性后，離心，取上清液準(zhǔn)備進(jìn)行電泳。SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜同上，SIRT1一抗孵育過夜，洗膜3次后，二抗孵育2 h，洗膜后，ECL發(fā)光檢測(cè)蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

2 結(jié)果

2.1 RNA干擾對(duì)SIRT1 mRNA和蛋白水平的影響 與正常對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)，而陰性對(duì)照組無明顯區(qū)別，見圖1、表1。

圖1 CAOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA后SIRT1的mRNA(A)和蛋白(B)表達(dá)水平1：正常對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：SIRT1-siRNA組Fig.1 Expression levels of SIRT1 mRNA(A) and protein(B) in CAOV3 cells transfected with siRNA SIRT11:Normal control group 2：Negative control group 3：SIRT1-siRNA transfected group

組別SIRT1/GAPDHmRNASIRT1/GAPDHprotein正常對(duì)照組0.49±0.070.67±0.15陰性對(duì)照組0.45±0.090.62±0.11SIRT1siRNA組0.23±0.09*0.28±0.10*

*P<0.01，與陰性對(duì)照組相比，compared with negative control group

2.2 SIRT1干擾對(duì)CAOV3細(xì)胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA 24 h后CAOV3細(xì)胞增殖率為(94.65±5.8)%，轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA 48 h后CAOV3細(xì)胞增殖率為(75.72±7.9)%，而轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA 72 h后細(xì)胞增殖率為(64.62±11.1)%。細(xì)胞增殖率明顯降低(P<0.01)，見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA后不同時(shí)間點(diǎn)CAOV3細(xì)胞增殖率Fig.2 Cell proliferation rate of CAOV3 cells at different time points after transfection with SIRT1-siRNA ±s,n=6)

2.3 SIRT1-siRNA對(duì)CAOV3細(xì)胞周期的影響 與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染SIRT1-siRNA的CAOV3細(xì)胞株中G1期細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少(P<0.01)，見表2。

表2 轉(zhuǎn)染SIRT1-siRNA對(duì)CAOV3細(xì)胞周期的影響

*P<0.01，與陰性對(duì)照組比較，compared with negative control group

2.4 SIRT1-siRNA對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響 Western blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，SIRT1-siRNA組p53、p21蛋白的表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)，p53處于高乙?；癄顟B(tài)，見圖3、表3。

圖3 Western blot檢測(cè)CAOV3細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)1：正常對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：SIRT1-siRNA組Fig.3 Expression of related proteins in CAOV3 cells by Western blot1:Normal control group;2:Negative control group;3:SIRT1-siRNA transfected group

組別p53/GAPDHproteinAc-p53/GAPDHproteinp21/GAPDHprotein正常對(duì)照組0.51±0.120.32±0.100.36±0.09陰性對(duì)照組0.49±0.090.30±0.080.33±0.08SIRT1-siRNA組0.69±0.14*0.47±0.08*0.49±0.09*

*P<0.01，與陰性對(duì)照組比較，compared with negative control group

2.5 SIRT1和p53的相互作用研究 經(jīng)p53抗體孵育后，120 kDa位置上檢測(cè)到SIRT1的表達(dá)條帶，Input組也檢測(cè)到相應(yīng)的條帶，表達(dá)量比IP組高，但陰性對(duì)照IgG組沒有檢測(cè)到條帶。表明IRT1和p53之間存在相互作用。見圖4。

圖4 免疫共沉淀檢測(cè)SIRT1與p53的相互作用Fig.4 Immunoprecipitation results of SIRT1 and p53

3 討論

SIRT1屬于Ⅲ類去乙?；讣易逯械囊粏T，可以去乙酰化眾多的蛋白質(zhì)，參與生物體內(nèi)各種各樣的生物學(xué)過程。近年來，關(guān)于SIRT1在腫瘤中的作用，由于實(shí)驗(yàn)室條件和細(xì)胞系的差異，結(jié)果千差萬別[11]。卵巢癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)非常復(fù)雜的病理過程，涉及多種生物學(xué)和遺傳學(xué)因素，有研究表明SIRT1在這一過程中起著重要作用[12]，但SIRT1在卵巢癌中的具體機(jī)制如何尚不明確。

本研究利用RNA干擾技術(shù)，轉(zhuǎn)染針對(duì)人SIRT1特異靶序列的siRNA，探討下調(diào)SIRT1的表達(dá)對(duì)CAOV3細(xì)胞增殖的影響及其可能機(jī)制。RT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示RNA干擾SIRT1 可明顯降低內(nèi)源性SIRT1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，說明SIRT1-siRNA可明顯下調(diào)SIRT1的表達(dá)，有一定的特異性。MTT結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA 48h和72 h后細(xì)胞增殖率明顯下降，說明干擾SIRT1能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。流式細(xì)胞結(jié)果表明，SIRT1-siRNA干擾組G1期細(xì)胞明顯增加，表明細(xì)胞周期被阻滯在G1期，間接表明干擾SIRT1可抑制CAOV3細(xì)胞增殖。

有研究表明，在細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)和發(fā)生DNA損傷時(shí)，SIRT1的表達(dá)增加可抑制由p53蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯[13]；采用特異性抑制劑抑制SIRT1蛋白的表達(dá)，使p53蛋白處于高乙?；癄顟B(tài)，增強(qiáng)了p53蛋白依賴的轉(zhuǎn)錄激活作用，增加了細(xì)胞對(duì)應(yīng)激狀態(tài)的敏感性[14]。但在卵巢癌CAOV3細(xì)胞中SIRT1和p53的關(guān)系尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染CAOV3細(xì)胞，p53蛋白表達(dá)水平明顯升高，說明p53蛋白的激活調(diào)控發(fā)生在翻譯后修飾水平，與Sun 等[15]結(jié)果一致。同時(shí)應(yīng)用乙?；痯53(lys382)抗體和p21抗體檢測(cè)下調(diào)SIRT1表達(dá)后p53的乙?；癄顟B(tài)和p21蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果表明SIRT1被干涉后p53處于高乙?；癄顟B(tài)，p21蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，說明抑制SIRT1的表達(dá)后，p53被快速乙?；M(jìn)而增強(qiáng)了p53依賴的轉(zhuǎn)錄激活，尤其是p21蛋白的轉(zhuǎn)錄激活。應(yīng)用免疫共沉淀方法表明CAOV3細(xì)胞中SIRT1和p53蛋白存在相互作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明下調(diào)SIRT1的表達(dá)可抑制卵巢癌CAOV3細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，且SIRT1和p53存在相互作用，說明SIRT1特異結(jié)合p53并使其去乙?；?，導(dǎo)致p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活的負(fù)調(diào)控，特別是p53介導(dǎo)的p21轉(zhuǎn)錄激活。這些結(jié)果提示了SIRT1可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起到癌基因的作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)控p53/p21通路相關(guān)。

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(編校：吳茜)

Effect of SIRT1 on the proliferation of ovarian cancer CAOV3 cells and its possible mechanism

LIU Heng1,2, YE Li-ping1Δ

(1.Department of Pathophysiology, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China; 2.Liaohe Oil Field General Hospital, Panjin 124010, China)

ObjectiveTo observe the effect of SIRT1 on the proliferation of ovarian cancer CAOV3 cells and its possible mechanism.MethodsOvarian cancer CAOV3 cells were transfected the Lipofectamine 2000 and were divided into normal control group，negative control group and SIRT1-siRNA group.The mRNA and protein expression levels of SIRT1 were detected by RT-PCR and Western blot.MTT method was used to detect the proliferation of RNA interference at 24h，48h and 72h，respectively.The distribution of CAOV3 cell cycle phase after RNA interference of SIRT1 for 72 hours was detected by flow cytometry.SIRT1，p53，p21 protein expression and p53 acetylation status were detected by Western blot with RNA interference of SIRT1 after 72 hours.The interaction between SIRT1 and p53 protein was verified by immunoprecipitation in CAOV3 cells.ResultsCompared with negative control group，the expression of mRNA and protein of SIRT1 in SIRT1-siRNA group decreased after transfection of SIRT1 for 72 hours.The survival rate of CAOV3 cells in SIRT1-siRNA group decreased significantly at 48 hours and 72 hours (P<0.01).The proportion of Sphase cells in CAOV3 cells transfected with SIRT1-siRNA for 72h was significantly decreased (P<0.01)，while the G1phase cells were significantly increased (P<0.01)，and the cells arrested in the G1phase.The expression of p53 and p21 proteins were significantly increased and the p53 was in higher acetylation status after transfection with SIRT1-siRNA for 72 hours (P<0.01).SIRT1 was interacted with p53 protein in CAOV3 cells confirmed by co-immunoprecipitation.ConclusionDownregulation of SIRT1 expression can inhibit the proliferation of ovarian cancer CAOV3 cells，which maybe connected with p53 at high acetylation status，and enhancing p53-dependent p21 transcriptional activation，thus blocking the cell cycle and inhibiting the cell proliferation.

SIRT1; siRNA; ovarian cancer; CAOV3; p53; p21

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.13

劉恒，女，碩士在讀，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，E-mail: 59588673@qq.com。葉麗平，通信作者,女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，E-mail: 43120890@qq.com

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