喬巍，邸軍，汪小莞，董旭，張琦，姜春娃，李江，李曉萌Δ

(1.東北師范大學 生命科學學院分子表觀遺傳學教育部重點實驗室，吉林 長春 130024；2.吉林省人民醫(yī)院 病理科，吉林 長春 130000；3.吉林大學口腔醫(yī)院 口腔修復科，吉林 長春 130041)

胃鉍鎂中藥組分對胃癌細胞周期的調(diào)節(jié)和裸鼠體內(nèi)腫瘤抑制的實驗研究

喬巍1?，邸軍2?，汪小莞1，董旭1，張琦1，姜春娃1，李江3Δ，李曉萌1Δ

(1.東北師范大學 生命科學學院分子表觀遺傳學教育部重點實驗室，吉林 長春 130024；2.吉林省人民醫(yī)院 病理科，吉林 長春 130000；3.吉林大學口腔醫(yī)院 口腔修復科，吉林 長春 130041)

目的 研究胃鉍鎂中藥組分(弗朗鼠李皮、茴香、石菖蒲、甘草和蘆薈)對胃癌細胞周期的調(diào)節(jié)作用和對胃癌移植瘤的生長抑制作用。方法 將胃鉍鎂和胃鉍鎂中藥總組分及其組分中弗朗鼠李皮、茴香、石菖蒲、甘草、蘆薈分別作用于胃癌細胞SGC-7901，MTT法檢測各處理組細胞的增殖狀態(tài)；流式細胞儀檢測細胞周期；Western blot檢測細胞周期相關蛋白的表達。構建裸鼠SGC-7901胃癌移植瘤模型，研究胃鉍鎂及其中藥總組分及其組分對胃癌移植瘤的生長抑制作用；免疫組化檢測STAT3信號通路相關蛋白STAT3、p-STAT3、Bcl-2、Cyclin D1和Survivin的表達情況。結果 胃鉍鎂中藥總組分及其組分中的弗朗鼠李皮、茴香和石菖蒲對SGC-7901細胞的抑制率顯著高于對照組(P<0.05)；流式檢測和Western blot結果顯示，胃鉍鎂、胃鉍鎂中藥總組分及其組分中弗朗鼠李皮、茴香和石菖蒲均可以使胃癌細胞阻滯于G1期(P<0.05)，并能夠有效下調(diào)細胞周期蛋白Cyclin A、B、D、E的表達；但甘草和蘆薈對胃癌細胞的增殖抑制和細胞周期阻滯作用不顯著。荷瘤裸鼠實驗結果顯示，胃鉍鎂中藥總組分組、弗朗鼠李皮組、茴香組和石菖蒲組對胃癌細胞的生長抑制作用顯著強于對照組和三聯(lián)藥(三種市售胃炎胃潰瘍類藥物聯(lián)合用藥)組(P<0.05)，并可以抑制STAT3的磷酸化，下調(diào)STAT3信號通路靶基因Bcl-2、CyclinD1和Survivin的表達。結論 胃鉍鎂及其中藥組分中的弗朗鼠李皮、茴香和石菖蒲可以顯著抑制胃癌細胞SGC-7901增殖，阻滯細胞周期于G1期，并可以在體內(nèi)抑制荷瘤裸鼠腫瘤的生長。

胃鉍鎂；中藥組分；胃癌；細胞周期

胃癌是全世界最常見的消化道腫瘤之一，已成為我國第二大致死癌癥，目前尚無有效的治療藥物[1-3]。胃鉍鎂顆粒屬新型化藥中藥結合制劑，對臨床上各種胃炎、胃潰瘍和胃黏膜損傷均有很好的療效[4]。在前期研究中，本課題組通過體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)胃鉍鎂在體外可以顯著抑制胃癌細胞SGC-7901增殖，促進細胞凋亡，作用效果主要來自胃鉍鎂-中藥總組分，而胃鉍鎂-化藥總組分抗腫瘤作用不顯著(正在投稿)。胃鉍鎂中藥組方由甘草浸膏粉、弗朗鼠李皮、茴香粉、石菖蒲和蘆薈5種單藥組成，每種單藥組分作用不同，抗腫瘤的具體有效單藥和機制尚不明確。本實驗旨在探討胃鉍鎂及其中藥組分對胃癌細胞株SGC-7901增殖和細胞周期的影響，及其在體內(nèi)抑制胃癌生長的效應，為開發(fā)低毒高效的抗腫瘤藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和實驗動物：胃癌SGC-7901 細胞系由本實驗室保存； 24只體質(zhì)量20～25g的6周齡BALB/c裸鼠購自吉林大學實驗動物中心。

1.1.2 試劑：DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國GIBCO公司；MTT購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司；胃鉍鎂藥物及其各組分由弘美制藥中國有限公司提供；三聯(lián)藥：克拉霉素片購自上海雅培制藥有限公司；阿莫西林膠囊購自聯(lián)邦制藥股份有限公司；埃索美拉唑鎂腸溶片購自阿斯利康制藥有限公司。鼠源β-Actin抗體購自武漢博士德、兔源STAT3一抗、p-STAT3一抗、Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D1、Cyclin E一抗、survivin一抗，鼠源Bcl-2一抗等均購自Santa Cruz，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔及羊抗鼠IgG二抗購自Sigma公司。

1.1.3 實驗儀器：酶標儀(ELx808，美國Bio-Tek公司)；流式細胞儀(EPICS-ELITE-ESP)；CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱(Hera cell 150，Heraeus，Germany)；熒光顯微鏡(Olympus，Japan)；電泳儀(JM-250，大連捷邁科貿(mào)有限公司)；電轉(zhuǎn)槽(Biorad)。

1.2 方法

1.2.1 藥物濃度設定:藥物濃度根據(jù)說明書定量，將如下濃度作為體外細胞實驗藥物處理的標準濃度，分別是胃鉍鎂100 μg/mL，胃鉍鎂中藥總組分71.4 μg/mL，中藥單藥組分包括甘草8.3 μg/mL、弗朗鼠李皮0.5 μg/mL、茴香0.5 μg/mL、蘆薈1 μg/mL、石菖蒲0.4 μg/mL。

將如下濃度作為體內(nèi)裸鼠移植瘤實驗藥物灌胃濃度，分別是三聯(lián)藥組(克拉霉素片33.2 mg/kg+阿莫西林膠囊101.7 mg/kg+埃索美拉唑鎂腸溶片1.8 mg/kg)、胃鉍鎂組(1849.5 mg/kg)、弗朗鼠李皮組(9.2 mg/kg)、茴香組(9.2 mg/kg)和石菖蒲組(7.7 mg/kg)。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和分組：將SGC-7901細胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2，溫度為37 ℃。細胞長滿后胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞分成7組，分別用1.2.1下所述濃度的胃鉍鎂、胃鉍鎂中藥總組分、弗朗鼠李皮、茴香、石菖蒲、甘草和蘆薈處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 MTT實驗：利用0.25%胰蛋白酶消化胃癌SGC7901細胞，以每孔1×104cells接種于96孔板中，5% CO2， 37 ℃孵箱培養(yǎng)。參照1.2.1，以標準加藥濃度(1倍劑量)的1/3濃度作為低濃度，3倍濃度作為高濃度，各種藥物分組參照1.2.2，每組均采用3個濃度作用于胃癌SGC-7901細胞，24 h后每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，繼續(xù)孵育4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。酶標儀在490 nm處測吸光度值(OD)。實驗重復3次。

1.2.4 細胞周期實驗：胃癌SGC7901細胞以每孔1×106cells接種于6孔板中，5%CO2，37 ℃培養(yǎng)，第2天細胞更換成1%FBS的DMEM培養(yǎng)，細胞分組處理和藥物濃度參照1.2.2，作用24 h后胰酶消化離心收集并懸于PBS中，70%乙醇固定30 min，用含RNase及碘化丙錠的染色液避光孵育30 min，流式細胞儀測定細胞周期，用MULTICYCLE軟件處理結果。

1.2.5 Western blot實驗：按照1.2.2分組和藥物濃度處理細胞24 h后，RIPA消化提取蛋白質(zhì)，并配置成相同濃度的蛋白質(zhì)溶液。配置12%分離膠和5%濃縮膠，調(diào)整電壓80～120 V電泳2 h，300 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜4 h，室溫牛奶封閉1 h，加一抗(Cyclin A，Cyclin B，Cyclin D1，Cyclin E，STAT3，p-STAT3，survivin，Bcl-2，稀釋比例均為1:200)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次5 min。加入二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG及羊抗鼠IgG，稀釋比例為1:500)室溫反應1 h，TBST洗滌3次，每次10 min。最后進行化學發(fā)光反應、曝光?；叶戎捣治?。實驗重復3次。

1.2.6 胃癌移植瘤模型實驗：SGC-7901細胞經(jīng)過胰酶消化，離心后用PBS懸起，使細胞濃度為1×107個/mL，接種于裸鼠背部皮下，每只接種0.15 mL細胞懸液。接種后10 d左右可見背部長出腫瘤塊，證明接種成功。將腫瘤接種成功的24只裸鼠隨機分成6組，生理鹽水組、三聯(lián)藥組(克拉霉素片+阿莫西林膠囊+埃索美拉唑鎂腸溶片)、胃鉍鎂組、弗朗鼠李皮組、茴香組、石菖蒲組，每組4只。各組均采用灌胃給藥，每次給藥體積2 mL，連續(xù)給藥3 w。每4 d測量一次腫瘤大小，用游標卡尺測量移植瘤的長徑(a)和與之垂直的短徑(b)，計算腫瘤體積(V=a×b2/2)，繪制腫瘤生長曲線。第26天處死小鼠，剖腫瘤、照相，稱取腫瘤質(zhì)量并計算抑瘤率。

抑瘤率=(模型組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量

1.2.7 免疫組化實驗：用4%的多聚甲醛固定腫瘤組織，石蠟包埋，常規(guī)切片。65 ℃烤片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，抗原修復，3%H2O2孵育10 min，PBS沖洗后進行免疫組化染色。適當比例滴加一抗(STAT3，P-STAT3，Cyclin D1，survivin，Bcl-2，稀釋比例均為1:200)，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次。滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3次。然后滴加現(xiàn)配制的DAB顯色，蘇木精復染，常規(guī)梯度脫水、透明、干燥、封片，熒光顯微鏡下拍照分析。

2 結果

2.1 胃鉍鎂及其各組分對胃癌SGC-7901細胞株增殖的影響 MTT結果顯示：與對照組相比，胃鉍鎂能明顯抑制SGC-7901細胞增殖，抑制率達到50%以上，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。胃鉍鎂中藥總組分，胃鉍鎂中藥組分中弗朗鼠李皮、茴香和石菖蒲均能顯著抑制SGC-7901細胞增殖(P<0.05)，但甘草、蘆薈的細胞增殖抑制效應不顯著。表明胃鉍鎂及其中藥組分弗朗鼠李皮、茴香和石菖蒲具有腫瘤抑制效應。見表1。

表1 胃鉍鎂及其中藥組分對SGC-7901細胞增殖的影響

*P<0.05，**P<0.01，與對照組比較，compared with control group

2.2 胃鉍鎂及其中藥組分對胃癌SGC-7901細胞周期的影響 流式結果顯示：與對照組比較，胃鉍鎂和其中藥總組分G1期細胞明顯增多(P<0.05)，S期和G2期百分比減少(P<0.05)；胃鉍鎂中藥組分中的弗朗鼠李皮、茴香和石菖蒲組處在G1期細胞數(shù)量也顯著增多(P<0.05)。見表2。說明胃鉍鎂及其中藥組分弗朗鼠李皮、茴香和石菖蒲能將SGC-7901細胞阻滯在G1期。

組別G1(%)S(%)G2(%)對照組54.029±2.45440.370±1.7525.601±0.715胃鉍鎂組75.785±1.874*22.075±1.396*2.141±0.560*胃鉍鎂中藥總組分組73.293±1.184*21.107±0.990*5.599±0.197弗朗鼠李皮組69.445±0.891*20.766±1.247*9.789±0.402茴香組65.291±1.240*27.333±1.028*7.376±0.423石菖蒲組64.462±0.699*34.900±1.291*1.638±0.591*甘草組52.603±0.70744.053±1.2383.343±1.109蘆薈組55.548±1.82238.841±0.8615.612±1.126

*P<0.05，與對照組比較，compared with control group

2.3 胃鉍鎂中藥總組分及各組分對細胞周期相關蛋白表達的影響 Western結果顯示：與對照組相比，胃鉍鎂中藥總組分及單組分弗朗鼠李皮、茴香、石菖蒲均可以使細胞周期蛋白Cyclin A、B、D、E的表達水平下調(diào)，見圖1。說明胃鉍鎂中藥組分及其單組分弗朗鼠李皮、茴香和石菖蒲能阻滯SGC-7901細胞周期在G1期，與流式細胞實驗結果一致。

圖1 胃鉍鎂中藥組分及其單組分對胃癌細胞周期蛋白表達的影響Fig.1 Effect of Weibimei and its Chinese medicine portion on the protein expression related to cell cycle in SGC-7901cell

2.4 胃鉍鎂中藥各組分對胃癌移植瘤的生長抑制作用 選取體外細胞實驗中增殖抑制作用顯著的藥物胃鉍鎂中藥總組分、單組分弗朗鼠李皮、茴香、石菖蒲作為實驗組，生理鹽水和三聯(lián)藥作為對照組，對移植瘤小鼠進行灌胃治療。結果顯示： 24 d后，與生理鹽水組和三聯(lián)藥組相比，胃鉍鎂中藥總組分組腫瘤的體積和質(zhì)量均明顯降低，抑瘤率顯著高于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；弗朗鼠李皮組、茴香組和石菖蒲組的腫瘤體積和質(zhì)量也顯著小于生理鹽水組(P<0.05)。見圖2和表3。表明胃鉍鎂中藥總組分、單組分弗朗鼠李皮、茴香和石菖蒲在體內(nèi)具有抑制腫瘤生長的作用。

圖2 各組裸鼠腫瘤的生長曲線±s，n=3)*P<0.05，**P<0.01，與對照組比較Fig.*P<0.05，**P<0.01， compared with control group

組別腫瘤重量(mg)腫瘤抑制率(%)生理鹽水組1340.83±66.99—三聯(lián)藥組1174.00±85.3012.44±6.36胃鉍鎂中藥總組分組323.17±24.8275.90±1.86**弗朗鼠李皮組272.33±15.6979.69±1.17**茴香組473.50±11.9064.69±0.89**石菖蒲組990.71±21.1626.65±0.75*

*P<0.05，**P<0.01，與對照組比較，compared with control group

2.5 胃鉍鎂及其中藥各組分對STAT3信號通路相關蛋白表達的影響 免疫組化結果顯示：與生理鹽水組比較，胃鉍鎂中藥總組分、弗朗鼠李皮、茴香和石菖蒲均可以明顯下調(diào)STAT3信號通路相關蛋白STAT3、p-STAT3的蛋白表達水平，并顯著抑制STAT3信號下游的增殖關聯(lián)基因Bcl-2、Cyclin D1和Survivin的蛋白表達水平，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4和圖3。表明胃鉍鎂中藥總組分及其單組分可在體內(nèi)抑制STAT3磷酸化，調(diào)控STAT3信號通路。

表4 腫瘤組織中STAT3信號通路相關蛋白表達的標記指數(shù)±s，%，n=4)

*P<0.05,**P<0.01，與對照組比較，compared with control group

圖3 胃鉍鎂中藥總組分及其單組分對胃癌腫瘤組織中STAT3信號通路相關蛋白表達的影響(×400)Fig.3 The protein expression related to STAT3 signaling pathway in tumor tissue treatment by Weibimei or its chinese medicine portion(×400)

3 討論

腫瘤的發(fā)生與細胞增殖和細胞周期異常密切相關，所以藥物對腫瘤細胞的增殖抑制和細胞周期的調(diào)控是評估藥物抗腫瘤療效的一項重要指標[5-7]。近年來，采用傳統(tǒng)中藥治療胃癌的實驗研究取得了很大的進展，大量研究證明中藥可通過干擾DNA合成，影響細胞周期調(diào)控因子的表達，阻滯細胞周期等多種方式抑制胃癌細胞的增殖[8-10]。中藥抗腫瘤具有多靶點，不良作用較低，且能提高機體免疫力的特性，越來越受到研究者的重視[11-12]。

胃鉍鎂顆粒屬新型化藥中藥結合制劑，化藥組方包括鋁酸鉍、重質(zhì)碳酸鎂和碳酸氫鈉，中藥組方包括甘草浸膏粉、弗朗鼠李皮、茴香粉、石菖蒲和蘆薈。其中，茴香有減輕胃腸脹氣、鎮(zhèn)痛的作用[13]；弗朗鼠李皮具有緩瀉、促進腸胃蠕動的作用；石菖蒲可促進消化，調(diào)節(jié)胃腸運動[14]。慢性萎縮性胃炎與胃癌密切關聯(lián)，胃鉍鎂對胃炎的確切療效和其組方的多樣性，提示其單藥組方藥物可能具有腫瘤殺傷作用。因此篩選胃鉍鎂的有效單藥組分，對胃癌的治療意義重大。

本實驗結果表明，胃鉍鎂中藥組分中的弗朗鼠李皮、茴香和石菖蒲均能夠顯著抑制胃癌SGC-7901細胞的增殖；在細胞周期實驗中，均能將胃癌細胞阻滯在G1期，并且下調(diào)細胞周期蛋白Cyclin A、B、D、E的表達，而這些作用在胃鉍鎂中藥組分中的另外兩種成分甘草組和蘆薈組中不顯著。由此可以推斷，弗朗鼠李皮、茴香和石菖蒲這3種成分可能是胃鉍鎂發(fā)揮抗腫瘤作用的主要活性成分。此外，本研究還通過體內(nèi)胃癌異位腫瘤模型考察了胃鉍鎂灌胃給藥對腫瘤生長的抑制作用，結果表明胃鉍鎂及其3種有效組分弗朗鼠李皮、茴香和石菖蒲具有抑制腫瘤生長的功能，與體外實驗結果一致。

有研究表明，STAT3信號的異?；罨灤┯谖赴┌l(fā)生發(fā)展的始終[15]。因此，本文進一步對胃鉍鎂及其有效組分對STAT3信號通路相關蛋白的表達進行了研究，通過對剝離下來的腫瘤組織進行包埋切片和免疫組化染色，結果顯示STAT3、p-STAT3、Bcl-2、Cyclin D1和Survivin的表達均下調(diào)，表明胃鉍鎂可以通過影響胃癌細胞中STAT3信號通路相關蛋白的表達來抑制胃癌細胞的增殖。

綜上所述，胃鉍鎂及其中藥組分中的弗朗鼠李皮、茴香和石菖蒲能夠有效顯著抑制胃癌細胞的增殖，將胃癌細胞阻滯于G1期；體內(nèi)實驗也證明了這些組分能顯著地抑制裸鼠皮下移植瘤的生長。胃鉍鎂及其3種有效中藥組分可作為潛在的胃癌治療藥物，其抗腫瘤機制可能與下調(diào)細胞周期蛋白，阻斷STAT3信號通路的轉(zhuǎn)導有關。

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(編校：吳茜)

Effects of Chinese medicine portions of Weibimei on cell cycle regulation and tumor inhibition in nude mice

QIAO Wei1?, DI Jun2?, WANG Xiao-wan1, DONG Xu1, ZHANG Qi1, JIANG Chun-wa1,LI Jiang3Δ, LI Xiao-meng1Δ

(1.Key Laboratory of Molecular Epigenetics of MOE, School of Life Sciences, Northeast Normal University, Changchun 130024, China;2.Department of Pathology, People’s Hospital of Jilin Province, Changchun 130000, China; 3.Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Stomatologic Hospital, Jilin University, Changchun 130041, China)

ObjectiveTo study the effects of Weibimei and its Chinese medicine portions(cortex frangulae, fennel powder, acorus tatarinowii, glycyrrhizae and asparagus) on cell cycle regulation in gastric cancer cells and growth inhibition in gastric cancer Xenografts.MethodsGastric cancer SGC-7901 cells were normally cultured and treated with Weibimei, extractum glycyrrhizae, cortex frangulae, fennel powder, acorus tatarinowii and asparagus.Then, the proliferation of SGC-7901 cells were detected by MTT assay, their effect on SGC-7901 cell cycle were measured by flow cytometry, and the expression of cell cycle related proteins were examined by Western blot.Animal models of SGC-7901 cells xenografts in nude mice were constructed to evaluate the growth inhibition effects of Weibimei and its Chinese medicine portions, and the expression of STAT3,p-STAT3, Cyclin D1, Bcl-2 and Survivin in gastric tumors were detected by immunohistochemical assays.ResultsWeibimei and its three kinds of Chinese medicine portions, cortex frangulae, fennel and acorus tatarinowii could obviously inhibit the proliferation of SGC-7901 cells, compared to control group, with a statistical significant difference (P<0.05).The cell cycle of SGC-7901 was arrested at G1 phase with cortex frangulae, fennel and acorus tatarinowii treatment, the expression of Cyclin A, B, D, E were decreased significantly (P<0.05).However, no significant effects was found in glycyrrhizae or asparagus group.Xenografts tumor sizes in Weibimei, cortex frangulae, fennel or acorus tatarinowi groups were much smaller than that in saline group or Triple Therapy group (three-kinds-drugs-combination for the treatment of gastric ulcer) (P<0.05).Xenografts experiments showed that the tumor growth in nude mice in Weibimei, cortex frangulae, fennel or acorus tatarinowi groups were significantly smaller than that in control group or in Triple Therapy Group (P<0.05), and phosphorylated STAT3, and STAT3 signaling targeted genes, including Bcl-2, Cyclin D1 and Survivin were all significantly down-regulated by immunostaining.ConclusionWeibimei and its Chinese medicine portions including cortex frangulae, fennel and acorus tatarinowii can could significantly inhibit the growth of SGC-7901 cells proliferation and arrested the cell cycle of G1 phase in vitro, and inhibit gastric cancer xenografts in nude mice in vivo.

Weibimei; chinese medicine portion; gastric cancer; cell cycle

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.06

科技部國際合作項目 ( 2010DFA31430)；吉林省科技廳(20130521010JH，20150101187JC，20150414007GH)， 吉林省教育廳課題(2015-526， 2015-551)；高?；究蒲袠I(yè)務費專項基金(2412015ZH005，2412016KJ037，130017507，130028633)；吉林省高等學校經(jīng)濟菌物高端科技創(chuàng)新平臺(吉高平合字【2014】B-1)； 國家自然科學基金( 30871301，30700827)； 引智計劃( B07017)

喬巍，女，碩士在讀，研究方向：腫瘤信號轉(zhuǎn)導，E-mail：qiaow634@nenu.edu.cn；邸軍，共同第一作者，男，主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤信號轉(zhuǎn)導，E-mail：Dijun1991@163.com；李曉萌，通信作者，女，教授，博士生導師，研究方向：腫瘤信號轉(zhuǎn)導，E-mail：lixm441@nenu.edu.cn；李江，共同通信作者，男，教授，碩士生導師，研究方向：腫瘤信號轉(zhuǎn)導，E-mail：ljiang@jlu.edu.cn。

R735.2

A