張碩峰，賈占紅，吳金英，丁巖，魏蕓，孫建寧

(北京中醫(yī)藥大學，北京 100102)

復方黃柏液對家兔皮膚創(chuàng)口肉芽組織增生的影響

張碩峰，賈占紅，吳金英，丁巖，魏蕓，孫建寧Δ

(北京中醫(yī)藥大學，北京 100102)

目的 觀察復方黃柏液對家兔皮膚破損創(chuàng)口愈合以及對肉芽組織中TGF-β1、VEGF、FGF-7表達的影響。方法 15只家兔隨機分為5組，即對照組、京萬紅組、復方黃柏液0.3、0.2、0.1 mL組，用手術刀在每只家兔耳內(nèi)側(cè)做長方形切口復制皮膚切除性傷口模型，分別使用復方黃柏液0.3、0.2、0.1 mL及京萬紅軟膏外敷傷口，給藥5 d，以肉芽組織覆蓋率評價創(chuàng)面愈合情況，并通過免疫組化方法觀察創(chuàng)口肉芽組織中TGF-β1、VEGF、FGF-7的表達。結(jié)果 復方黃柏液可不同程度提高創(chuàng)口肉芽組織覆蓋率，使創(chuàng)口肉芽組織中VEGF、FGF-7的表達增加，顯著高于對照組(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論 復方黃柏液可明顯促進肉芽組織增生，促進皮膚傷口的愈合。

復方黃柏液；創(chuàng)口愈合；TGF-β1；VEGF；FGF-7

復方黃柏液由黃柏、連翹、金銀花、蒲公英、蜈蚣組成。前期研究結(jié)果表明復方黃柏液具有抗感染，促進皮膚傷口愈合的作用[1]。結(jié)合前期實驗經(jīng)驗，本研究仍采用兔耳創(chuàng)傷模型，但改變了創(chuàng)口的形狀，采用長方形切口，垂直于創(chuàng)口長軸取材，便于對創(chuàng)口愈合進行多指標監(jiān)測，而不受圓形傷口的限制[2]。以創(chuàng)口肉芽組織覆蓋率，肉芽組織中TGF-β1、VEGF、FGF-7的表達作為觀測指標，以確定復方黃柏液對創(chuàng)口愈合的影響，并初步分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：大耳白家兔，15只，雄性，2～2.5 kg。北京市昌揚西山養(yǎng)殖場提供，許可證編號：SCXK(京)2011-0010，合格證號：11402300001140。

1.1.2 藥品和試劑：復方黃柏液(批號：1209101，規(guī)格：100 mL/瓶，山東漢方制藥有限公司)，京萬紅軟膏，(批號：211954，規(guī)格：20 g/支，天津達仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司)。第一抗體: VEGF抗體(博士德BA0407)；TGF-β1抗體(博士德BA0290)；FGF7抗體(博士德BA0853)。免疫組化染色試劑盒：Histostain-Plus Mouse Primary (Cat. No. 85-6643, Invitrogen, USA)；Histostain-Plus Rabbit Primary(Cat. No. 85-6743, Invitrogen, USA)。DAB Kit (Cat. No. 00-2014, Invitrogen, USA)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法：實驗前在家兔耳廓內(nèi)側(cè)用75%酒精擦拭。第2天用2把手術刀并聯(lián)(間隔5 mm)在家兔左右耳內(nèi)側(cè)，各做5 mm×10 mm長方形切口，撕去損傷皮膚，用消毒棉簽擦拭至軟骨板完全暴露，軟骨板未見明顯損傷即為造模成功，用膠貼棉覆蓋傷口并醫(yī)用膠布固定，復制皮膚切除性傷口模型。

1.2.2 分組給藥：將造模家兔隨機分為5組，每組3只，即對照組、京萬紅組、復方黃柏液0.3、0.2、0.1 mL組。造模后即刻將相應藥物原液(京萬紅軟膏約0.2 g/處創(chuàng)口)滴加或涂抹在醫(yī)用膠貼棉貼處，覆蓋傷口并醫(yī)用膠布固定。每天換藥1次，對照組使用生理鹽水0.3 mL/處創(chuàng)口。共給藥5 d。

1.2.3 指標檢測：取家兔耳部創(chuàng)面連同邊緣區(qū)域，4%甲醛溶液固定，垂直包埋，垂直創(chuàng)口長軸切片，做HE染色，免疫組化檢測VEGF、TGF-β1、FGF7在創(chuàng)口肉芽組織中的表達。鏡下觀察測量傷口肉芽組織未覆蓋區(qū)域距離，并計算肉芽組織覆蓋率。

免疫組化各指標各樣本隨機選取創(chuàng)口肉芽組織3個視野，用圖像分析軟件Image pro-plus6.0，分別計算各視野IOD值，并計算均值。

2 結(jié)果

2.1 復方黃柏液對家兔耳部皮膚切除性傷口愈合的影響 與對照組相比，各劑量復方黃柏液可不同程度促進家兔切除性傷口的愈合，使創(chuàng)口肉芽組織覆蓋率增加(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 復方黃柏液對家兔耳部皮膚切除性傷口愈合的影響

*P<0.05，與對照組相比較，compared with control group

2.2 復方黃柏液對家兔耳部皮膚切除性傷口肉芽組織TGF-β1、FGF7和VEGF表達的影響 與對照組相比，各劑量復方黃柏液可不同程度促進家兔切除性傷口的愈合，使創(chuàng)口肉芽組織中FGF7、VEGF表達增加(P<0.05，P<0.01)，但對創(chuàng)口肉芽組織TGF-β1表達作用不明顯，差異無統(tǒng)計學意義。見圖1，表2。

圖1 復方黃柏液對家兔耳部皮膚切除性傷口肉芽組織TGF-β1、FGF7和VEGF表達的影響Fig.1 Effect of FFHB liquid on TGF-1β and VEGF and FGF7 expression in granulation tissue of rabbit ear skin excision wound healing

組別劑量(mL/處創(chuàng)口)例數(shù)TGF-β1FGF7VEGF對照組-6109.4±41.064.8±19.642.0±15.1復方黃柏液組0.3697.4±20.0116.0±30.3**89.7±31.0*0.2691.1±59.3130.0±55.4*69.6±16.8*0.16113.4±49.4123.5±53.4*86.2±40.6*京萬紅組0.2g694.7±27.3140.2±28.6**96.3±43.3*

*P<0.05，**P<0.01，與對照組相比較，compared with control group

3 討論

創(chuàng)傷愈合，是醫(yī)學研究中的重要課題，肉芽組織形成數(shù)量的多少與質(zhì)量的好壞直接影響創(chuàng)面的修復程度。創(chuàng)面的修復過程是一個復雜的生物學過程，研究表明多種生長因子，如成纖維細胞生長因子(FGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)等在組織修復過程中發(fā)揮著重要作用——刺激上皮細胞遷移、增殖以及促進角質(zhì)細胞分層和分化，是創(chuàng)面愈合的重要因素[3]。

FGF家族由23個成員組成，主要由角質(zhì)細胞，成纖維細胞，血管內(nèi)皮細胞，平滑肌細胞，軟骨細胞和肥大細胞分泌，F(xiàn)GF-7是該家族重要的一員，多種組織的損傷會上調(diào)FGF-7的表達，F(xiàn)GF-7誘導表達主要通過激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)及環(huán)磷腺苷依賴的蛋白激酶途徑完成。角質(zhì)化細胞通過釋放IL-1β 調(diào)整成纖維細胞FGF-7 表達，IL-1β 是最有效的成纖維細胞FGF-7誘導物[4]。FGF-7在急性創(chuàng)傷后表達增加，其高水平表達與傷口恢復時間一致，他加快了上皮細胞增殖和上皮化的速率，能明顯刺激角質(zhì)細胞增殖和遷移從而促進再上皮化[5]；同時，F(xiàn)GF-7還能增加對活性氧(ROS)解毒物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，如非硒依賴性谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化物還原酶Ⅵ、核呼吸因子2 和肺部表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白等，從而降低角質(zhì)細胞的凋亡，通過保護角質(zhì)細胞起到促進上皮化的作用[6-8]；此外FGF-7還能促進內(nèi)皮細胞的增殖以及上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達，對新生血管形成起到一定的作用。VEGF的轉(zhuǎn)錄和分泌在急性創(chuàng)傷的早期增加。創(chuàng)傷形成后，活化的血小板、巨噬細胞在創(chuàng)面愈合中釋放VEGF，促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，加速肉芽的生長，同時能誘導表皮基底細胞移行，加速創(chuàng)面的上皮化[9-11]。本研究表明復方黃柏液可不同程度增加創(chuàng)口肉芽組織中VEGF、FGF-7的表達，提示復方黃柏液可促進創(chuàng)傷局部血管增生，使創(chuàng)面局部的微循環(huán)得以重建，增加局部血流量，促進肉芽組織增生，并通過FGF-7的作用，促進創(chuàng)面組織再上皮化，進而促進傷口愈合。

轉(zhuǎn)換生長因子-β (TGF-β)是一種多效性的細胞因子，主要由巨噬細胞，角質(zhì)細胞，成纖維細胞和血小板分泌，在細胞增殖、細胞遷移、細胞存活和凋亡、免疫調(diào)節(jié)、上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)換(epitheial-mesechymal transition，EMT)、細胞外基質(zhì)生成、炎癥等創(chuàng)傷修復期的多個生物學過程中起重要作用[12-13]。人皮膚組織中轉(zhuǎn)化生長因子β有β1、β2、β3三個亞型，均可刺激結(jié)締組織生長因子的表達，其中轉(zhuǎn)化生長因子β1可促進創(chuàng)面早期愈合，對于創(chuàng)面愈合的結(jié)局具有重要意義[14]。創(chuàng)傷形成后，隨著轉(zhuǎn)化生長因子β在各細胞中表達增強，VEGF在細胞中的表達也明顯增強，從而促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，加速肉芽的生長，加速創(chuàng)面的愈合[15]。本研究結(jié)果表明復方黃柏液促進肉芽組織中TGF-β1的表達增加作用不明顯，這可能與模型動物創(chuàng)傷形成后局部損傷組織TGF-β1表達均顯著增加有關。

綜上所述，復方黃柏液具有明顯的促進皮膚傷口愈合的作用，其作用機制可能與復方黃柏液促進肉芽組織的生長，促進創(chuàng)面組織再上皮化有關。

[1] 張碩峰，賈占紅，吳金英，等.復方黃柏液對家兔皮膚破損創(chuàng)口愈合的影響及其抗菌活性[J].中國新藥雜志，2014，11：1330-1332，1236.

[2] Luisa AD, Aime LB. Wound healing methods and protocols[M]. Totowa, New Jersey: Humana press Inc,2003:55-65.

[3] Sivamanik K,Garcia MS,Isseroff RR.Wound re-epithelialization: modulating keratinocyte migration in wound healing[J]. Frontiers in bioscience: a journal and virtual library,2006,12:2849-2868.

[4] Marchand-Adam S,Plantier L,Bernuau D,et al.Keratinocyte growth factor expression by fibroblasts in pulmonary fibrosis: poor response to interleukin-1beta[J]. Am J Respir Cell Mol Biol,2005,32(5):470-477.

[5] 陳偉，付小兵，周崗，等.增生性癱痕內(nèi)3種成纖維細胞生長因子及其受體基因的表達[J].中華實驗外科雜志，2004，21(9)：1111-1113.

[6] Raja，K Sivamani, Miki Shirakawa Garci, et al. Wound re-epithelialization: modulating keratinocyte migration in wound healing[J]. Front Biosci，2007,12: 2849-2868.

[7] 伊海英，孫曉艷，付小兵，等.堿性成纖維細胞生長因子的研究進展[J].解放軍醫(yī)學雜志,2008，33(6)：776-778.

[8] 宗憲磊，蔡景龍，姜篤銀. 角質(zhì)細胞生長因子研究進展[J].中國修復重建外科雜志,2009，23(2)：188-193.

[9] Saaristo A, et al. Vaseular endothelial growth factor-C accelerates diabetic wound healing[J]. Am J Pathol，2006,169(3):1080-1087.

[10] 楊化超，李茂，黃文. 人臍帶間充質(zhì)干細胞對小鼠皮膚創(chuàng)面愈合及VEGF表達的影響[J]. 第三軍醫(yī)大學學報，2016，38(5)：456-458.

[11] Muthukumar T,Anbarasu K,Prakash D,et al.Effect of growth factors and ro-inflammatory cytokines by the collagen biocomposite dressing material containing Macrotyloma uniflorum plant extract-In vivo wound healing[J]. Colloids Surf B Biointerfaces,2014,121: 178-188.

[12] 張愛軍，閆志勇. TGF-β對創(chuàng)傷愈合與瘢痕形成的影響及中藥的干預作用[J].西北藥學雜志,2013,28(1):101-105.

[13] Kerstin JR, Janette R, Charlotte V, et al. A role for TGF-beta1-induced cellular responses during wound healing of the non-scarring early human fetus?[J].J Invest Dermatol,2007,127(11):2656-2667.

[14] Colwell AS, Phan TT, Kong W, et al. Hypertrophic scarfibroblasts have increased connective tissue growth factor expression after transforming growth factor-beta stimulation[J]. Plast Reconstr Surg,2005,116(5):1387-1390, 1391-1392.

[15] 馬信龍，謝軍. VEGF, TGF-β1在骨缺損不愈合中表達的實驗研究[J].中華骨科雜志， 2002，22(9)：561-566.

(編校：吳茜)

Effect of Fufang Huangbai Ye on granulation tissue hyperplasia of rabbit skin wound

ZHANG Shuo-feng, JIA Zhan-hong, WU Jin-ying, DING Yan, WEI Yun, SUN jian-ningΔ

(Bejing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

ObjectiveTo observe the effect of Fufang Huangbai Ye(FFHB liquid) on wound healing and expression of TGF-β1, VEGF and FGF7 in granulation tissue of rabbit. MethodsUsing scalpel created rectangle wound through the skin to the level of the cartilage on the ventral aspect of each rabbit ear. Wounds had been treated with FFHB liquid 0.3,0.2,0.1 mL/d for 5 days. The coverage of granulation tissue and expression of TGF-β1, VEGF and FGF7 in granulation tissues of each group were observed and compared. ResultsFFHB liquid can increase the coverage of granulation tissue of wound and the expression of VEGF and FGF-7 in granulation tissue obviously (P<0.05,P<0.01). ConclusionFFHB liquid can promote the granulation tissue proliferation and wound healing.

Fufang Huangbai Ye;wound healing;TGF-β1;VEGF;FGF7

張碩峰，男，博士，副教授，研究方向：中藥藥理，E-mail：shuofengzhang@sina.com；通信作者，孫建寧，女，本科，教授，研究方向：中藥藥理，E-mail：jn_sun@sina.com。

R285.5

B

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.11