羅宏偉，張四喜

(1.唐山市傳染病醫(yī)院 七病區(qū)，河北 唐山 063000；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 檢驗科，吉林 長春 130000)

白藜蘆醇抗乙型肝炎病毒及肝炎所致纖維化的初步研究

羅宏偉1，張四喜2Δ

(1.唐山市傳染病醫(yī)院 七病區(qū)，河北 唐山 063000；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 檢驗科，吉林 長春 130000)

目的 初步研究白藜蘆醇抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)及肝纖維化的作用。方法 采用rAAV8-1.3HBV腹腔注射新生SD大鼠建立大鼠HBV感染模型，建模成功后將大鼠隨機(jī)分為4組，每組5例，即陰性對照組、白藜蘆醇低劑量組、白藜蘆醇高劑量組、陽性對照組，分別給予生理鹽水、20 mg/kg白藜蘆醇、40 mg/kg白藜蘆醇、0.1 mg/kg阿昔洛韋灌胃。2、4、8、12周后尾靜脈采血檢測乙肝表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎E抗原(HBeAg)、乙肝病毒的脫氧核糖核酸(HBV-DNA)。建立HSC-T6細(xì)胞模型，分別以生理鹽水、白藜蘆醇灌胃大鼠制備對照組及白藜蘆醇血清，采用AlamarBlue法觀察白藜蘆醇血清對HSC的增殖作用，RealtimePCR法分析白藜蘆醇血清對HSC細(xì)胞I型膠原及TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響。Western Blot法分析白藜蘆醇血清對HSC細(xì)胞I型膠原及TGF-β1蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 采用ELISA法檢測HBsAg、HBeAg、HBV-DNA發(fā)現(xiàn)第2周、第4周陰性對照組HBsAg、HBeAg的表達(dá)明顯高于其余3組P<0.05，其中第2周對照組HBsAg、HBeAg的表達(dá)最高分別為(4118±367)IU/mL、(160.2±56.90)IU/mL。而HBV-DNA則在第2周陰性對照組與其余3組相比具有明顯差異P<0.05。AlamarBlue法結(jié)果白藜蘆醇血清可抑制HSC-T6增殖，Realtime PCR結(jié)果白藜蘆醇血清可以顯著抑制HSC-T6的I型膠原及TGF-β1 mRNA表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示白藜蘆醇血清可以顯著抑制HSC-T6的I型膠原及TGF-β1蛋白表達(dá)。結(jié)論 白藜蘆醇能抑制HBV同時通過抑制I型膠原及TGF-β1達(dá)到阻止肝纖維化的結(jié)果。

白藜蘆醇；HBV；I型膠原；TGF-β1

白藜蘆醇是一種多酚類小分子化合物，存在于多種植物中，如虎杖、葡萄、桑葚等[1]。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有抗心血管疾病、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等作用[2-4]。近年來白藜蘆醇在抗肝炎病毒方面的研究[5-6]，更是為中藥治療肝炎拓展了空間。但是大部分的報道尚停留在細(xì)胞層面，體內(nèi)實驗研究較少，更沒有乙肝病毒對肝炎后肝硬化的影響報道。本實驗采用rAAV8-1.3HBV注射法建立大鼠模型，進(jìn)而研究白藜蘆醇對乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)及肝纖維化的影響。HBV感染過程及肝纖維化形成更貼近人類。同時為白藜蘆醇的抗乙肝病毒研究提供了新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 rAAV8-1.3HBV，北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所提供；SPF級SD新生鼠仔(合格證號SCXK(冀)2008-16)，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；乙肝表面抗原(HBsAg)、HBeAg ELISA試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；乙肝病毒的脫氧核糖核酸(HBV-DNA)定量檢測試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；白藜蘆醇，Sigma-Aldrich；HSC-T6，購自上海中醫(yī)藥大學(xué)；RealTime PCR試劑盒，上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物科技有限公司；Col I、TGF-β1抗體，Oncogene公司；AlamarBlue試劑盒，上海前塵生物科技有限公司。

β-actin、Col I、TGF-β1由上海生工生物工程技術(shù)公司設(shè)計合成：

β-actin： Forward :TGACGAGGCCCAGAGCAAGA

Resverse:ATGGGCACAGTGTGGGTGAC

Col I：Forward :ACTCAGCCGTCTGTGCCTCA

Resverse:GGAGGCCTCGGTGGACATTA

TGF-β1：Forward :AATTCCTGGCGTTACCTTGGT

Resverse:GAGGGTCGGTTACTGTCATG

1.2 方法

1.2.1 乙肝大鼠模型的建立：按照孫瀟[7]的方法建立大鼠乙肝模型，首先選取SPF級SD新生鼠仔，采用腹腔注射1×1011拷貝數(shù)rAAV8-1.3HBV，即217 μL/只，建立大鼠乙肝模型，陰性對照組選三只大鼠給予相同體積的PBS腹腔注射。2周后采用ELISA檢測大鼠血清中HBsAg、乙型肝炎E抗原(HBeAg)。結(jié)果陽性者模型建立成功。選取造模成功的20只大鼠隨機(jī)分成4組，每組5例。白藜蘆醇低劑量組給予20 mg/kg白藜蘆醇，2次/天灌胃，白藜蘆醇高劑量組給予40 mg/kg白藜蘆醇，一天兩次灌胃，陽性對照組給予阿昔洛韋(揚(yáng)子江藥業(yè)，H20046139)0.1 mg/kg，2次/天灌胃。陰性對照組給予等量的蒸餾水2次/天灌胃。分別在2、4、8、12周尾靜脈采血檢測HBsAg、HBeAg、HBV-DNA情況。

1.2.2 白藜蘆醇對HSC細(xì)胞I型膠原及TGF-β1表達(dá)的影響：

① 實驗分組：將20只SPF級SD新生鼠仔隨機(jī)分為2組，每組10例，對照組給予1 mg/100 g生理鹽水灌胃，白藜蘆醇組給予40 mg/kg灌胃，2次/天，連續(xù)給藥一周后，進(jìn)食12 h，次日斷頭取血，收集2組血清后于56 ℃水浴滅活30 min，分裝，-70 ℃?zhèn)溆?。本實驗的實驗過程嚴(yán)格遵守《實驗動物保護(hù)條例》

② 白藜蘆醇血清抑制細(xì)胞增殖試驗：采用AlamarBlue法檢測血清抑制細(xì)胞增殖。將上述收集的對照組及白藜蘆醇組血清分為含10、20、40%血清各3組。每個濃度的組別均有細(xì)胞組、對照組、背景組，每組6個復(fù)孔。調(diào)整HSC-T6細(xì)胞懸液為1×105/mL。按100 μL/孔接種到96孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)，白藜蘆醇組添加不同濃度的對照組/白藜蘆醇組血清及AlamarBlue液10 μL/孔。對照組無細(xì)胞但添加與白藜蘆醇組相同的DMEM和血清，并與白藜蘆醇組相同的時間點加入AlamarBlue液。背景組添加與對照組相同的DMEM和血清，但不加AlamarBlue液。上述各組置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中在2、4、8、16、24 h時測波長在570 nm及595 nm的各孔吸光度。計算Reduced AB=(117.2×A570(細(xì)胞組-背景組)-80.5×A595(細(xì)胞組-背景組))/(155.7×A595(對照組-背景組)-14.6×A570(對照組-背景組))

③ PCR檢測I型膠原及TGF-β1表達(dá)：用含有10%對照組大鼠血清/白藜蘆醇大鼠血清的DMEM孵育HSC-T6細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞后用Trizol提取總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA，并取1 μL RNA和99 μLDEPC加入96孔板中，多功能酶標(biāo)儀于260 nm、280 nm測(A260/280)，計算RNA純度。

取4 μg RNA，加random hexamer primer(0.2 μg/mL)1 μL，DEPC水補(bǔ)充體積至12 μL，70 ℃火浴5 min后，加入5×reactin buffer 4 μL、Ribonuclease inhibitor(20 μ/μL)1 μL、10 mM dTNPmix 2 μL，25 ℃火浴5 min，再加入Revert Aid M-uLVRT(200 μ/μL)1 μL，終體系為20 μL。25 ℃火浴10 min后42 ℃火浴60 min，最后72 ℃火浴10 min，最終反轉(zhuǎn)錄成cDNA。之后94 ℃變性15 s，57 ℃退火20 s，68 ℃延伸30s，進(jìn)行RealTimePCR擴(kuò)增。2%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，整體反應(yīng)進(jìn)行3次。

④ Western blot：與上一步驟相同方法孵育HSC-T6細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞后采用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心后取上清。BCA法測定上清液總蛋白含量，取含30 μg總蛋白的上清液進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，經(jīng)硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移，5%脫脂牛奶TBS-T封閉后，分別與I型膠原、TGF-β1抗體孵育，PBS洗滌，在與HRP偶聯(lián)的第二抗體作用，反應(yīng)信號與ECL底物化學(xué)發(fā)光檢測。

2 結(jié)果

2.1 血清中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA的檢測情況 經(jīng)rAAV8-1.3HBV造模后的大鼠，2 w后采血，圖1為HBsAg的檢測結(jié)果，第二周大鼠血清中陰性對照組的含量最高為(4118±367)IU/mL，陰性對照組與白藜蘆醇低劑量組(3352±286)IU/mL、白藜蘆醇高劑量組(2981±143)IU/mL、陽性對照組(3121±221)IU/mL相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。其中白藜蘆醇的2組與陽性對照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異。而白藜蘆醇低劑量組與高劑量組相比具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。第4周時陰性對照組的HBsAg(1054±119)IU/mL的含量仍為最高，且與其余3組(白藜蘆醇低劑量組(809±81)IU/mL、白藜蘆醇高劑量組(668±112)IU/mL、陽性對照組(531±78)IU/mL)相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異。其中白藜蘆醇低劑量組與陽性對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。8周后各組間相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異。圖2為HBeAg的檢驗結(jié)果。兩周時空白對照的HBeAg表達(dá)達(dá)到了最高為(160.2±56.90)IU/mL。且對照組與其余3組(白藜蘆醇低劑量組(124±19)IU/mL、白藜蘆醇高劑量組(115±15)IU/mL、陽性對照組(67±16)IU/mL)相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，陽性對照組與白藜蘆醇低劑量組和高劑量組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。四周時陰性對照組(50±13)IU/mL與白藜蘆醇高劑量組(28±11)IU/mL及陽性對照(24±8)IU/mL之間存在差異(P<0.05)。四周后各組間無差異。圖3為血中HBV-DNA的檢測結(jié)果。2周時陰性對照組(3.26×106±5.48×105)IU/mL與其余3組[白藜蘆醇低劑量組(0.92×106±0.14×106)IU/mL、白藜蘆醇高劑量組(6.39×105±1.08×105)IU/mL、陽性對照組(4.76×105±0.85×105)IU/mL]的比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。同時白藜蘆醇低劑量組與陽性對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。其余時間段以及各組間相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異。

圖1 大鼠血中HBsAg含量(n=5)*P<0.05，與陰性對照組相比；#P<0.05，與白藜蘆醇高劑量組相比；&P<0.05，與陽性對照組相比Fig.1 Content of HBsAg in rats blood (n=5)*P<0.05，compared with negative control group；#P<0.05，compared with high-dose resveratrol；&P<0.05，compared with positive control group

圖2 大鼠血中HBeAg含量(n=5)*P<0.05，與陰性對照組相比；#P<0.05，與陽性對照組相比Fig.2 Content of HBeAg in rats blood (n=5)*P<0.05, compared with negative control group; #P<0.05, compared with positive control group

圖3 大鼠血中HBV DNA含量(n=5)*P<0.05，與陰性對照組相比；#P<0.05，與陽性對照組相比Fig.3 Content of HBV DNA in rats blood (n=5)*P<0.05, compared with negative control group；#P<0.05, compared with positive control group

2.2 白藜蘆醇血清抑制細(xì)胞增殖試驗 本實驗采用10、20、40%的大鼠血清/白藜蘆醇血清的DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞，結(jié)果如圖4所示10、20%的血清可明顯促進(jìn)HSC-T6的Reduced AB值增長，40%的血清濃度在8 h后促進(jìn)作用開始明顯。但各濃度在16 h后增殖速度放緩，24 h促進(jìn)增值的速度有所下降，40%血清濃度的最為明顯。故白藜蘆醇血清在24 h對HSC-T6細(xì)胞的ReducedAB值出現(xiàn)抑制，即白藜蘆醇能抑制HSC-T6增殖，所以白藜蘆醇能抑制肝纖維化的進(jìn)展。

圖4 白藜蘆醇血清對HSC-T6的增殖抑制試驗(n=6)Fig.4 Inhibition of Proliferation of HSC-T6 by Resveratrol Serum(n=6)

2.3 PCR檢測I型膠原及TGF-β1表達(dá) 本實驗采用PCR檢測I型膠原及TGF-β1表達(dá)，見圖5，白藜蘆醇血清作用于HSC-T6細(xì)胞24 h后I型膠原(1.33±0.250)及TGF-β1(1.72±0.520)的表達(dá)明顯較對照組(3.98±0.72)、(6.22±0.94)減少(P<0.05)。即白藜蘆醇能明顯抗纖維化。

圖5 PCR檢測I型膠原及TGF-β1表達(dá)(n=10)0：β-actin；1：白藜蘆醇組；2：對照組；*P<0.05，與陰性對照組相比Fig.5 Expression of Col I and TGF-β1 by PCR (n=10)0：β-actin；1：Resveratrol group；2：Control group;*P<0.05, compared with negative control group

2.4 Western blot 根據(jù)圖6所示為Western blot檢測I型膠原及TGF-β1表達(dá)情況。結(jié)果可見白藜蘆醇組血清能明顯抑制HSC-T6的I型膠原及TGF-β1的表達(dá)，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

圖6 Western Blot檢測I型膠原及TGF-β1表達(dá)*P<0.05，與陰性對照組相比Fig.6 Expression of Col I and TGF-β1 by Western Blot*P<0.05, compared with negative control group

3 討論

乙肝是我國的常見傳染性疾病，每年政府都投入大量的人力、物力進(jìn)行乙肝的防治工作。這也使得乙肝研究更加緊迫[8-9]。但是自然狀態(tài)下只有人及少數(shù)的靈長類動物能夠被感染[10]，所以合適乙肝的動物模型難以建立。本實驗是利用rAAV8病毒載體感染大鼠，從而將乙肝病毒帶入大鼠肝細(xì)胞內(nèi)，使病毒能夠穩(wěn)定的復(fù)制。模型建立成功后我們對大鼠進(jìn)行白藜蘆醇及生理鹽水灌胃，之后觀察不同時間點大鼠血中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA的情況。可見前四周HBsAg、HBeAg白藜蘆醇組中的HBsAg、HBeAg明顯少于陰性對照組，白藜蘆醇高劑量組與陽性對照組沒有明顯的差異。第2周時白藜蘆醇可使HBV-DNA減少，與陰性對照組相比具有明顯差異。4周后上述3種指標(biāo)在各組間均未見明顯的差異。這主要是因為實驗采用的是新生鼠仔隨著鼠仔體重的增加，將HBsAg、HBeAg、HBV-DNA稀釋導(dǎo)致各組之間差異不明顯[11]。

白藜蘆醇抗病毒的作用已經(jīng)被人們所熟知，其主要作用為免疫調(diào)節(jié)的改變，這也同時為白藜蘆醇抗乙肝病毒創(chuàng)造了研究背景[12-15]。通過抗病毒的研究我們已經(jīng)證實了白藜蘆醇的抗乙肝作用，那么白藜蘆醇的肝抗纖維化作用，有待于發(fā)覺。肝纖維化是慢性HBV感染后結(jié)果，主要是由于HSC的活化同時成纖維細(xì)胞合成大量細(xì)胞外基質(zhì)。HSC活化后會促進(jìn)I型膠原及TGF-β1表達(dá)增加導(dǎo)致肝纖維化的加重。故HSC、I型膠原和TGF-β1在肝纖維中至關(guān)重要。本實驗中利用含有白藜蘆醇的血清作用于HSC細(xì)胞之后通過計算ReducedAB值、PCR及Western blot進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠?qū)е翲SC表達(dá)的I型膠原和TGF-β1減少，進(jìn)而阻止肝纖維化。所以白藜蘆醇能夠抑制HBV，同時通過抑制I型膠原和TGF-β1減少阻止肝纖維化。

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(編校：師維康)

Preliminary study of resveratrol on anti - hepatitis B virus and hepatitis induced fibrosis

LUO Hong-wei1, ZHANG Si-xi2Δ

(1.Department of Seven Ward, Tangshan Infectious Disease Hospital, Tangshan 063000 China; 2.Department of Laboratory, the First Hospital of Jilin University, Changchun 130000 China)

ObjectiveTo study the effect of resveratrol on hepatitis B virus (HBV) and hepatic fibrosis.MethodsThe rat model of HBV infection was established by intraperitoneal injection of rAAV8-1.3HBV. After successfully establishing the modle, were randomly divided into four groups: negative control group, resveratrol low dose group, high dose group, positive control group, and five rats in each group. Giving a physiological saline, 20 mg/kg respectively resveratrol, 40 mg/kg, 0.1 mg/kg acyclovir via gastrogavage respectively. 2、4、8、12 weeks later ,we detected the HBsAg, HBeAg, HBV-DNA via tail vein blooding. HSC-T6 cell model was established. Then rats were divided into two groups, control and resveratrol serum group. Each group was administrated with normal sodium and resveratrol via gastrogavage to make serum. The HSC-T6 viability was observed by AlamarBlue assay. The expression of Col I and TGP-β1 mRNA was determined by Realtime PCR. The expressions of Col I and TGP-β1 Protein was analyzed by WesternBlot.ResultsUsing ELISA method to detect HBsAg、HBeAg、HBV-DNA and found that the expression of HBsAg and HBeAg of negative control group were significantly higher than the rest of the three groups (P<0.05) at the second and the fourth week. The highest expression of HBsAg and HBeAg were (4118±367) IU/mL、(160.2±56.90) NCU/mL at the second week. The expression of HBV-DNA of negative control group is significantly higher than the rest of the three groups (P<0.05) at the second week. AlamarBlue assay indicated that different concentration of serum of resveratrol can inhibit HSC-T6 proliferation. Compared with control group, serum with drug resveratrol significantly down-regulated the mRNA and protein expression of Col I and TGP-β1.ConclusionResveratrol inhibits HBV and liver fibrosis by inhibiting type I collagen and TGF-β1.

Resveratrol; HBV; Col I; TGP-β1

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.12.007

羅宏偉，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：肝病的發(fā)病機(jī)制，E-mail：514329822@qq.com；張四喜，通信作者，男，碩士，副教授，研究方向：肝病檢驗技術(shù)，E-mail：wsk01342@163.com。

R575.1；R657.3+1

A