張桂云，楊偉強(qiáng)，林常青，謝建華

(1.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品深加工及安全福建省高等學(xué)校應(yīng)用技術(shù)工程中心，福建漳州363000; 2.漳州市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，福建漳州363000)

分散固相萃取－超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中的7種農(nóng)藥殘留

張桂云1，楊偉強(qiáng)2，林常青1，謝建華1

(1.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品深加工及安全福建省高等學(xué)校應(yīng)用技術(shù)工程中心，福建漳州363000; 2.漳州市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，福建漳州363000)

以分散固相萃取技術(shù)為前處理手段，結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，建立一種快速檢測茶葉中7種農(nóng)藥殘留的方法.茶葉樣品經(jīng)前處理后，采用UPLC－MS/MS法檢測分析.用空白樣品提取液配制基質(zhì)工作曲線，外標(biāo)法定量.結(jié)果表明，多菌靈、丁醚脲、喹螨醚在0.1～2.0、滅多威在1.0～20.0、噻蟲嗪、吡蟲啉、噻螨酮在2.0～40.0 ng·mL－1的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其檢出限為0.10～5.00 μg·kg－1.平均加標(biāo)回收率為75.9%～116.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～6.1%.該方法簡便、可靠、穩(wěn)定，可用于茶葉中多種農(nóng)藥殘留的快速檢測與確證.

分散固相萃取;超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜;茶葉;農(nóng)藥殘留

0 引言

我國茶文化底蘊(yùn)深厚，綠茶、紅茶、烏龍茶、花茶、普洱茶等品種茶葉的種植歷史悠久，產(chǎn)量高居世界第一［1］.然而，近年來由于濫用農(nóng)藥引發(fā)的茶葉中農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題極大地影響了我國茶葉的對外出口，同時(shí)也引起了人們對茶葉飲品及其相關(guān)制品食用安全的高度關(guān)注.因此，嚴(yán)格控制茶葉中農(nóng)藥的殘留量，倒逼無公害化綠色茶葉生產(chǎn)成為我國當(dāng)下亟待解決的課題.這不僅要求相關(guān)部門完善和制定嚴(yán)格的茶葉農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，而且需要建立和發(fā)展能夠快速、有效檢測茶葉中多種農(nóng)藥殘留檢測的分析方法，更好地滿足人們對健康茶葉的要求［2－4］.

茶葉基質(zhì)復(fù)雜，已知的化學(xué)成分多達(dá)數(shù)百種.目前，茶葉中農(nóng)藥殘留常見的檢測方法主要有GC、GCMS/MS、HPLC、HPLC－MS等，但對茶葉中多種農(nóng)藥殘留的檢測關(guān)鍵在于前處理方法的選擇和優(yōu)化，以去除共提取物中影響檢測結(jié)果、污染儀器的成分.相比于傳統(tǒng)的磺化法、固相萃取技術(shù)(SPE)、凝膠色譜凈化技術(shù)(GPC)等前處理技術(shù)［5－6］.分散固相萃取(QuEChERS)作為一種新型的前處理技術(shù)，具有速度較快、簡單方便、經(jīng)濟(jì)、高效、耐用和安全實(shí)用的特點(diǎn)，近年來被不斷完善和推廣應(yīng)用［7－8］，但是QuEChERS與HPLC－MS－MS聯(lián)用用于茶葉中農(nóng)藥殘留的檢測研究較少.其主要提取操作步驟是先在樣品中加入乙腈等溶劑進(jìn)行侵泡提取，然后加入無水硫酸鎂和氯化鈉除水，待提取液分層后，上清液經(jīng)無水硫酸鎂和PSA、GCB、C18、中性氧化鋁等固體吸附劑除去樣品提取液中的大部分非目標(biāo)化合物，從而達(dá)到凈化提取液的效果.相比于傳統(tǒng)的SPE技術(shù)，分散固相萃取可以直接將吸附劑分散于提取液中，整個(gè)凈化過程無需預(yù)淋洗、淋洗、洗脫等繁雜和冗長的步驟，大大節(jié)約了前處理的時(shí)間.此外，分散固相萃取可以根據(jù)基質(zhì)和提取劑的性質(zhì)，靈活地選擇凈化劑的種類和用量，對不同種類的樣品凈化效果更佳［9－11］.

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC－MS/MS)結(jié)合了超高效液相杰出的分離能力和串聯(lián)質(zhì)譜的超高靈敏度，是一種快速發(fā)展的分析技術(shù)［12］.將其與分散固相萃取技術(shù)相結(jié)合，兼具兩者的優(yōu)點(diǎn)，可以真正實(shí)現(xiàn)多種農(nóng)藥殘留的快速檢測.本文探索并建立了一種以分散固相萃取技術(shù)為前處理手段，以超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法為分析技術(shù)的檢測方法，實(shí)現(xiàn)了多菌靈、滅多威、噻蟲嗪、吡蟲啉、噻螨酮、丁醚脲、喹螨醚［13－16］等7種農(nóng)藥殘留的快速檢測.該方法具有操作簡單、快速高效、結(jié)果可靠的優(yōu)點(diǎn)，既可以滿足對茶葉中多種農(nóng)藥殘留的定性分析，也完全可以滿足定量分析的檢測要求［4］.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高壓液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 1290－6460，美國Agilent公司);渦旋振蕩器(QL－861，中國其林貝爾公司);均質(zhì)機(jī)(T10，德國IKA公司);高速離心機(jī)(TG16－WS，中國湘儀公司);氮吹儀(DN－24A，上海比朗儀器公司).甲醇、乙腈為色譜純(德國Merck公司);N－丙基乙二胺(PSA)粉、石墨化炭黑(GCB)粉、無水硫酸鎂、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉購自安譜公司;其他試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為超純水系統(tǒng)(英國ELGA公司)制備.

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液:多菌靈、滅多威、噻蟲嗪、吡蟲啉、噻螨酮、丁醚脲均購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測所，質(zhì)量濃度均為100.0 μg·mL－1;喹螨醚為德國Dr固體試劑，用甲醇配制成100.0 μg·mL－1.于冰箱中4℃保存.混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確移取適量的7種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液，然后用甲醇進(jìn)行稀釋，使混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度分別為:多菌靈0.2 μg·mL－1、滅多威2.0 μg·mL－1、噻蟲嗪4.0 μg·mL－1、吡蟲啉4.0 μg·mL－1、噻螨酮4.0 μg·mL－1、丁醚脲0.2 μg·mL－1、喹螨醚0.2 μg·mL－1.于4℃保存.

1.2 儀器工作條件

色譜條件:Agilent Zorbax SB C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.8 mm).流動相A為乙腈，B為0.1%(體積分?jǐn)?shù)，以下同)甲酸水溶液.梯度洗脫程序(以A的體積分?jǐn)?shù)表示):0～0.8 min時(shí)，A為5%;0.8～2.0 min時(shí)，A由5%升至35%;2.1 min時(shí)升至75%;5.0～6.0 min時(shí)，A繼續(xù)由75%升至95%;隨后降至5%.流速為0.4 mL·min－1，進(jìn)樣量為5 μL.

質(zhì)譜條件:電噴霧正離子模式電離(ESI+).電噴霧電壓4 000 V;干燥氣溫度300℃，流量5 L·min－1;霧化氣壓力0.35 MPa;鞘氣溫度250℃，流量11 L·min－1;多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)檢測.各種農(nóng)殘檢測的質(zhì)譜參數(shù)見表1.

表17 種農(nóng)藥的質(zhì)譜檢測參數(shù)Tab.1MS parameters of 7 synthetic colorants

1.3 試驗(yàn)方法

稱取粉碎茶樣約5 g于50 mL離心管中，加入5 mL純凈水浸泡30 min.加入20.0 mL乙腈，4 g無水硫酸鎂，1 g氯化鈉，0.5 g檸檬酸氫二鈉，1 g檸檬酸鈉，渦旋振蕩2 min，10 000 r·min－1離心.取上層乙腈提取液2.0 mL于預(yù)先加有20 mg PSA、10 mg GCB及200 mg無水硫酸鎂的離心管中，渦旋30 s，再以5 000 r·min－1離心5 min.取上清液于40℃下氮?dú)獯抵两?，?.0 mL甲醇－水(1∶1，體積比)溶解.經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，供UPLC－MS/MS分析.以空白樣品添加不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)該前處理方法凈化，測定并繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取條件的優(yōu)化

茶葉中含有大量的色素、有機(jī)酸、茶多酚等物質(zhì)，理想的提取劑應(yīng)能夠最大限度地溶解目標(biāo)物而減少對基質(zhì)共提物的溶解.樣品中農(nóng)藥殘留的提取物有很多種，乙腈是其中一種，由于農(nóng)藥的極性不同，乙腈對其溶解能力也不同，且乙腈對色素的提取能力較弱，相對更適合于茶葉中多種農(nóng)藥殘留的提取.為了提高萃取效率，在提取前加入一定量的純水浸潤干制茶葉樣品，使提取溶劑與樣品充分接觸，然后進(jìn)行提取.

很多農(nóng)藥對溶液的pH值敏感，控制提取溶液的pH值對提取效率有較大的影響［7］.例如，多菌靈在酸性條件下穩(wěn)定，在堿性溶液中隨pH值的升高分解加快.因此，對多農(nóng)藥殘留的提取，加入合適的緩沖鹽來控制提取溶液的pH值很有必要.實(shí)驗(yàn)通過加入檸檬酸鈉/檸檬酸氫二鈉將提取溶液的pH值控制在5～7范圍內(nèi)，減少農(nóng)藥殘留的分解.

此外，溫度也是引起農(nóng)殘降解的重要因素之一.均質(zhì)、超聲過程中產(chǎn)生的熱量不利于農(nóng)藥殘留的準(zhǔn)確測定，因此，實(shí)驗(yàn)采用振蕩提取的方式進(jìn)行多農(nóng)藥殘留的提取.

2.2 分散固相萃取吸附劑的選擇

選擇合適的固相萃取吸附劑凈化樣品是分散固相萃取的核心環(huán)節(jié).理想的固相萃取吸附劑直接分散于提取液中，應(yīng)盡可能多地吸附提取液中的干擾成分，同時(shí)盡可能多地保留待測目標(biāo)化合物.常用的固相萃取吸附劑包括PSA、GCB、C18、中性氧化鋁等，它們的吸附對象各有不同［7，16］.對于茶葉樣品提取液，GCB可除去茶葉提取液中大部分色素，而PSA對有機(jī)酸、酚類具有很強(qiáng)的親和力.因此，實(shí)驗(yàn)采用PSA+ GCB的組合吸附劑對樣品進(jìn)行凈化處理.

由于固相萃取吸附劑通常為多孔物質(zhì)，其對目標(biāo)化合物也具有一定的非選擇性物理吸附.因此，固相萃取吸附劑的用量不是越多越好，需要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化.各種農(nóng)藥殘留的回收率隨PSA和GCB用量增加而變化的情況見圖1.從實(shí)際結(jié)果可以看出，采用20 mg PSA和10 mg GCB配比作為固相萃取的吸附劑用于樣品的凈化處理，效果最好，回收率最高，回收范圍為85%～110%;40 mg PSA和20 mg GCB次之; 10 mg PSA和5 mg GCB效果最差.實(shí)驗(yàn)采用20 mg PSA和10 mg GCB配比作為固相萃取吸附劑，在保證測定結(jié)果的同時(shí)，可適當(dāng)增加用量，以確保處理后的樣品純凈、透明.

2.3 質(zhì)譜、色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中多菌靈、丁醚脲、滅多威、噻蟲嗪、喹螨醚、吡蟲啉、噻螨酮7種農(nóng)藥殘留檢測模式均為正離子模式.實(shí)驗(yàn)時(shí)分別測定單個(gè)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，得到其優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)，包括檢測離子對、裂解電壓、碰撞能(見表1).按照1.2的色譜條件，以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動相，設(shè)置合適的梯度洗脫程序，即可實(shí)現(xiàn)7種農(nóng)藥的有效分離(見圖2).

2.4 線性范圍與檢出限

由于茶葉成分復(fù)雜，其基質(zhì)對質(zhì)譜檢測的影響較大，所以結(jié)果定量檢測中，為了減小基質(zhì)效應(yīng)的影響，以不含農(nóng)藥殘留的茶葉樣品添加不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，按照前述方法進(jìn)行處理得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，測定藥物殘留的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度(y)與其質(zhì)量濃度(x，ng·mL－1)在一定的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(見表2)，相關(guān)系數(shù)均大于0.99.以10倍信噪比為檢出限(質(zhì)譜)，根據(jù)儀器給出的曲線第一濃度點(diǎn)的信噪比值，可以計(jì)算出多菌靈、滅多威、噻蟲嗪、吡蟲啉、噻螨酮、丁醚脲、喹螨醚的檢出限分別為0.10、0.50、5.00、5.00、4.00、0.50、0.10 μg·kg－1.其線性方程和檢出限如表2所示.

表2 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Tab.2Linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

2.5 精密度和準(zhǔn)確度

通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)來評價(jià)方法的準(zhǔn)確度和精密度.在前處理前，將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到5 g茶葉基質(zhì)中，然后按照1.3中試驗(yàn)方法，進(jìn)行前處理提取并測定.其中，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分為3個(gè)水平，每個(gè)水平平行測定6次.分析結(jié)果見表3，測得回收率為75.9%～116.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤6.1%，由此表明該方法具有良好的重現(xiàn)性，準(zhǔn)確度和精密度良好，能夠滿足日常檢測的要求.

表3 回收率和精密度(n=6)Tab.3Results of tests for recovery and precision

續(xù)表3

2.6 實(shí)際樣品的檢測

應(yīng)用所建立的方法，對100份送檢茶葉樣品進(jìn)行了檢測.已累計(jì)檢測出50余個(gè)含有農(nóng)藥殘留的樣品，其中檢出率較高的農(nóng)藥為多菌靈(0.8～4.0 μg·kg－1)、噻蟲嗪(100～625 μg·kg－1).

3 結(jié)論

運(yùn)用分散固相萃取技術(shù)，建立一種超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法用于茶葉中多菌靈、丁醚脲、滅多威、喹螨醚、噻蟲嗪、吡蟲啉、噻螨酮等7種農(nóng)藥殘留的快速檢測.該方法具有操作簡單方便、測定快速高效、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn)，提高了茶葉中多種農(nóng)殘留的檢驗(yàn)效率，可應(yīng)用于日常實(shí)際樣品中檢測，為食品質(zhì)量安全檢測提供了有效的技術(shù)支持.

［1］程啟坤.中國大陸茶產(chǎn)業(yè)概況及發(fā)展趨勢［J］.茶博覽，2010(12):22－25.

［2］童小麟，鄒偉.歐盟新的茶葉農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)分析與對策研究［J］.檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2009，19(3):56－59.

［3］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.茶葉中448種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法: GB/T 23205—2008［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

［4］中華人民共和國衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.食品中最大農(nóng)藥殘留限定量:GB 2763—2014［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

［5］康長安，何娟.農(nóng)藥殘留樣品前處理技術(shù)研究進(jìn)展［J］.世界農(nóng)業(yè)，2006(10):47－49.

［6］和曉彤.農(nóng)藥殘留分析前處理技術(shù)研究進(jìn)展［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，38(17):132－135.

［7］鄭文慧，葉江雷，王秀彬，等.分散固相萃取法在農(nóng)藥殘留檢測中應(yīng)用的進(jìn)展［J］.分析儀器，2011(4):23－27.

［8］袁雪嬋.QuEChERS方法及其在食品農(nóng)藥多殘留分析中的應(yīng)用［J］.中國食品添加劑，2009(2):144－148.

［9］徐娟，陳捷，葉弘毅，等.QuEChERS提取與高效液相色譜－電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法檢測茶葉中的19種農(nóng)藥殘留［J］.分析測試學(xué)報(bào)，2009，30(9):990－995.

［10］王連珠，周昱，黃小燕，等.基于QuEChERS提取方法優(yōu)化的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜中51種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留［J］.色譜，2013，31(12):1 167－1 175.

［11］葉江雷，金貴娥，吳云輝，等.QuEChERS法提取凈化結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)法快速檢測茶葉中農(nóng)藥殘留［J］.食品科學(xué)，2013，34 (12):265－271.

［12］馮楠，路勇，姜潔，等.QuEChERS超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速篩查食品中73種有毒有害物質(zhì)［J］.食品科學(xué)，2013，34(16):214－220.

［13］郭靈安，雷紹榮，伸伶俐，等.UPLC－MS/MS法分析茶葉中的滅多威農(nóng)藥殘留［J］.食品研究與開發(fā)，2012，33(7): 110－117.

［14］董靜，宮小明，張立，等.QuEChERS－高效液相色譜法檢測蔬菜中的吡蟲啉、蟲酰肼、阿維菌素和噻螨酮［J］.分析試驗(yàn)室，2008，27(3):91－94.

［15］張新忠，羅逢健，劉光明，等.超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉和土壤中丁醚脲及其代謝物的殘留［J］.分析化學(xué)，2011，39(9):1 329－1 335.

［16］周利，羅逢健，張新忠，等.納米竹炭分散固相萃取/超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定綠茶中的農(nóng)藥多殘留［J］.分析測試學(xué)報(bào)，2014，33(6):642－647.

(責(zé)任編輯:洪江星)

Determination of seven pesticide residues in tea by dispersive solid－phase extraction and ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry

ZHANG Guiyun1，YANG Weiqiang2，LIN Changqing1，XIE Jianhua1
(1.Zhangzhou Institute of Technology，The Applied Technical Engineering Center of Further Processing and Safety of Agricultural Products，Higher Education Institutions in Fujian Province，Zhangzhou，F(xiàn)ujian 363000，China; 2.Zhangzhou Product Quality Supervision Institute，Zhangzhou，F(xiàn)ujian 363000，China)

A new method of ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry(UPLC－MS/MS)combined with dispersive solid－phase extraction as the pretreatment had been established for the analysis of seven pesticide residues in tea.The pretreated tea samples were analyzed by UPLC－MS/MS.And the matrix－matched external standard calibration curves were used for quantitative analysis.The results show that carbendazim，diafenthiuron，fenazaquin has good linear relationship in the range of 0.1～2.0 ng·mL－1，methomyl has good linear relationship in the range of 1.0～20.0 ng·mL－1，thiamethoxam，imidacloprid，hexythiazox has a good linear relationship in the range of 2.0～40.0 ng·mL－1.The limit of detection of this method was 0.10～5.00 μg·kg－1.The average recoveries of the added sample were 75.9%～116.8%with relative standard deviation of 2.6%～6.1%.The method is simple，reliable and stable，and was suited for the rapid detection and confirmation of multiple pesticide residues in tea.

dispersive solid－phase extraction;ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry;tea;pesticide residues

O657.7

A

10.7631/issn.1000－2243.2016.06.0896

1000－2243(2016)06－0896－05

2016－03－01

謝建華(1976－)，副教授，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)應(yīng)用方面的研究，xiejh2001@163.com

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015J01356);福建省教育廳科技類資助項(xiàng)目(JA15690);漳州市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZZ2016j25);漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級科研資助項(xiàng)目(ZZY1504)