于　力，劉　瑩，鄭曉聰，王津津，賈　鵬，何俊強(qiáng)，劉　葒（深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳　518045）

?

泰國(guó)輸華斑節(jié)對(duì)蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的檢測(cè)與分析

于力，劉瑩，鄭曉聰，王津津，賈鵬，何俊強(qiáng)，劉葒
（深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳518045）

摘要：為研究進(jìn)口斑節(jié)對(duì)蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒（Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus， IHHNV）的風(fēng)險(xiǎn)，本文采用了世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）2015版手冊(cè)中推薦的PCR方法，對(duì)2015年從泰國(guó)輸華的329批次斑節(jié)對(duì)蝦進(jìn)行了IHHNV檢測(cè)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其陽(yáng)性率高達(dá)36.8%，且主要是感染1型和2型，以及風(fēng)險(xiǎn)不明的未知型。因此，來(lái)自泰國(guó)的斑節(jié)對(duì)蝦具有較高的IHHNV傳入風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)加強(qiáng)針對(duì)IHHNV的進(jìn)口監(jiān)測(cè)，減少其對(duì)我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖的影響。

關(guān)鍵詞：傳染性皮下和造血器官壞死病毒；斑節(jié)對(duì)蝦；未知基因型；風(fēng)險(xiǎn)

對(duì)蝦傳染性皮下和造血器官病是養(yǎng)殖對(duì)蝦的重要疫病，可引起極高的死亡率（＞90%）［1-2］或生長(zhǎng)發(fā)育畸形［3-4］，對(duì)世界對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)具有嚴(yán)重影響。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列入須通報(bào)疫病。其病原是傳染性皮下和造血器官病毒（IHHNV），其宿主為斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）、南美白對(duì)蝦（P. vannamei）和南美藍(lán)對(duì)蝦（P. stylirostris）等。

IHHNV屬于細(xì)小病毒科［5］，是已知最小的對(duì)蝦病毒。病毒粒子大小為20～22 nm，基因組為單鏈DNA，長(zhǎng)約3.9 kb［6-7］。該病毒至少有3個(gè)基因型，其中1型主要分布在美洲和東亞，2型主要分布在東南亞，這兩種基因型均為感染型［8-9］。3型又分為3A型和3B型，其中3A型主要分布在東非、印度和澳大利亞等地區(qū)，而3B型則主要分布在印度太平洋地區(qū)。3A型和3B型將部分基因序列嵌入宿主對(duì)蝦的基因組，但不具備感染性［10］。

本研究采用了2015版OIE手冊(cè)推薦的PCR方法，對(duì)2015年從泰國(guó)輸華的斑節(jié)對(duì)蝦進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查與風(fēng)險(xiǎn)分析。

1　材料與方法

1.1樣品與對(duì)照

樣品為2015年從泰國(guó)進(jìn)口到中國(guó)的活斑節(jié)對(duì)蝦，共329批次，均無(wú)發(fā)育畸形等典型臨床癥狀。取樣部位為鰓和皮下組織。陽(yáng)性對(duì)照為本實(shí)驗(yàn)室保存的IHHNV陽(yáng)性組織，陰性對(duì)照為健康的斑節(jié)對(duì)蝦組織。

1.2引物合成

引物采用2015版OIE手冊(cè)推薦的PCR引物，詳見(jiàn)表1，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1　IHHNV檢測(cè)引物

1.3DNA提取

將采集的鰓組織勻漿后提取DNA。本實(shí)驗(yàn)用到的組織均使用QIAamp DNA Mini QIAcube Kit （QIAGEN）進(jìn)行DNA提取。

1.4PCR檢測(cè)

使用Ex Taq（TAKARA）進(jìn)行PCR檢測(cè)，引物終濃度為400 nM。根據(jù)OIE手冊(cè)（2015版），先使用392F/R引物對(duì)所有樣品進(jìn)行檢測(cè)。若有陽(yáng)性，則使用309F/R與MG831F/R引物進(jìn)行分型。以上3對(duì)引物的PCR反應(yīng)程序均為95 ℃ 5 min，35個(gè)循環(huán)（95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min），72 ℃ 7 min。

1.5電泳與測(cè)序

PCR產(chǎn)物使用毛細(xì)管電泳儀QIAxcel （QIAGEN）來(lái)分析，陽(yáng)性樣品送華大基因進(jìn)行測(cè)序，與NCBI BLAST后，相似度95%以上確定為陽(yáng)性。

2　結(jié)果

2015年從329批斑節(jié)對(duì)蝦中，共檢出IHHNV陽(yáng)性121批，陽(yáng)性率為36.8%。按照OIE手冊(cè)（2015版），引物392F/R能檢出IHHNV的所有基因型，而引物309F/R能檢出1型和2型，MG831F/R能檢出3A和3B型。若392F/R引物陽(yáng)性，而309F/ R和MG831F/R均為陰性，則無(wú)法判斷其基因型，本文暫稱為未知型（圖1）。檢測(cè)結(jié)果匯總?cè)绫?與圖2所示。使用卡方檢驗(yàn)，季度之間陽(yáng)性率無(wú)顯著差異（P＞0.05）。IHHNV各基因型所占的百分比例如圖3所示。

圖1　IHHNV未知型電泳

表2　2015年泰國(guó)輸華斑節(jié)對(duì)蝦IHHNV檢測(cè)結(jié)果

圖2　泰國(guó)輸華斑節(jié)對(duì)蝦IHHNV按季度檢測(cè)結(jié)果

2015年第一、二季度的IHHNV陽(yáng)性率相對(duì)較低，第三、四季度相對(duì)較高。每個(gè)季度的基因型主要為未知型和1/2型，而3A/3B以及1/2和3A/3B型共存的所占比較很小。

泰國(guó)2015年輸華斑節(jié)對(duì)蝦的IHHNV各基因型所占的百分比中，1型/2型所占比例最大，為47%；未知型占44%；3A/3B型占6%；1型/2型和3A/3B型占3%（圖3）。

圖3　泰國(guó)輸華斑節(jié)對(duì)蝦IHHNV基因型分布

3　討論

本研究采用了OIE手冊(cè)（2015版）推薦的PCR方法，對(duì)2015年從泰國(guó)輸華的斑節(jié)對(duì)蝦進(jìn)行了IHHNV檢測(cè)分析。結(jié)果表明，總體陽(yáng)性率高達(dá)36.8%，說(shuō)明IHHNV感染的斑節(jié)對(duì)蝦未必會(huì)表現(xiàn)出臨床癥狀，這與OIE手冊(cè)所介紹的情況一致。陽(yáng)性樣品中主要是感染1型和2型，以及未知風(fēng)險(xiǎn)的未知型。有研究發(fā)現(xiàn)，斑節(jié)對(duì)蝦對(duì)IHHNV感染具有較高的耐受性［11］，這也與該實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，說(shuō)明IHHNV對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦致死率低，使其成為攜帶與傳播IHHNV的風(fēng)險(xiǎn)［12］。從季節(jié)而言，第一、二季度的IHHNV陽(yáng)性率相對(duì)較低，而第三、四季度相對(duì)較高，但無(wú)顯著差異，可能是由偶然因素或波動(dòng)所引起的。

關(guān)于未知型，在OIE手冊(cè)中未見(jiàn)相關(guān)描述，相關(guān)文獻(xiàn)也未有提及。但有文獻(xiàn)指出IHHNV的基因變異率較高［13］，且現(xiàn)行方法無(wú)法區(qū)分出所有的基因型［14］。因此未知型可能是IHHNV的突變型，或者是由于現(xiàn)行方法的局限未能區(qū)分出的基因型，所以對(duì)其感染性以及風(fēng)險(xiǎn)未知。因此對(duì)于IHHNV未知型的樣品應(yīng)該謹(jǐn)慎處理，同時(shí)也應(yīng)對(duì)其進(jìn)行深入研究。

本研究還觀察到4批1型/2型和3A/3B型共存的現(xiàn)象，這與Tang等［15］觀察到的現(xiàn)象一致，說(shuō)明即使確認(rèn)了非感染型IHHNV，也不能排除其含有感染型的可能。所以在實(shí)際檢測(cè)工作中應(yīng)同時(shí)使用309F/R和MG831F/R引物進(jìn)行分型分析。

綜上所述，來(lái)自泰國(guó)的斑節(jié)對(duì)蝦具有較高的傳入IHHNV風(fēng)險(xiǎn)，且未知風(fēng)險(xiǎn)的未知基因型占有近一半的比例。即使斑節(jié)對(duì)蝦本身對(duì)IHHNV耐受，但也可能將其傳播給其他易感對(duì)蝦，造成極高的死亡率。我國(guó)是對(duì)蝦養(yǎng)殖大國(guó)，同時(shí)也從東南亞進(jìn)口大量對(duì)蝦，因此應(yīng)加強(qiáng)IHHNV的進(jìn)口監(jiān)測(cè)，以更好地防控該病，減少其對(duì)我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖的影響。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Lightner D V，Redman R M，Bell T A. Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis，a newly recognized virus disease of penaeid shrimp［J］. J Invertebrate Pathol，1983，42（1）： 62-70.

［2］ Lightner D V，Redman R M， Bell T A， et al. Detection of IHHN virus in Penaeus stylirostris and P. vannamei imported into Hawaii［J］. J World Aquaculture Society，1983，14 （1/2/3/4）：212-225.

［3］ Chayaburakul K，Nash G，Pratanpipat P，et al. Multiple pathogens found in growth-retarded black tiger shrimp Penaeus monodon cultivated in Thailand［J］. Dis Aquat Org，2004，60：89-96.

［4］ Bray W A，Lawrence A L，Leung-trujillo J R. The effect of salinity on growth and survival of Penaeus vannamei，with observations on the interaction of IHHN virus and salinity［J］. Aquaculture，1994，122：133-146.

［5］ Fauquet C M，Mayo M A，Maniloff J，et al. Virus taxonomy： classification and nomenclature of viruses. eighth report of the international committee on taxonomy of viruses［M］. Elsevier Academic Press，2005：1259.

［6］ Bonami J R，Trumper B，Mari J，et al. Purification and characterization of IHHN virus of penaeid shrimps［J］. J Gen Virol，1990，71：2657-2664.

［7］ Nunan L M，Poulos B T，Lightner D V. Use of polymerase chain reaction（PCR）for the detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus（IHHNV）in penaeid shrimp［J］. Mar Biotechnol，2000（2）：319-328.

［8］ Tang K F J，Lightner D V. Low sequence variation among isolates of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus （IHHNV） originating from Hawaii and the Americas［J］. Dis Aquat Org，2002，49：93-97.

［9］ Tang K F J，Poulos B T，Wang J，et al. Geographic variations among infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus （IHHNV） isolates and characteristics of their infection［J］. Dis Aquat Org，2003，53：91-99.

［10］ Tang K F J， Lightner D V. Infectious hypodermal and

hematopoietic necrosis virus（IHHNV）in the genome of the black tiger prawn Penaeus monodon from Africa and Australia［J］. Virus Res，2006，118：185-191.

［11］ Flegel T W，Nielsen L，Thamavit V，et al. Presence of multiple viruses in non-diseased， cultivated shrimp at harvest［J］. Aquaculture，2004，240：55-68.

［12］ Toms C J，Roswin J L，Anbu R，et al. Occurrence of viral pathogens in Penaeus monodon post-larvae from aquaculture hatcheries［J］. Data Brief，2015（4）：170-176.

［13］ Refugio R S，Andrew J B，Leroy R M J，et al. Genetic signature of rapid IHHNV （infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus） expansion in wild penaeus shrimp populations［J］. PLoS One，2010，5（7）：e11799.

［14］ Praveen R，Muhammed P S，Kjersti K，et al. Genomics，molecular epidemiology and diagnostics of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus［J］. Indian J Virol，2012， 23（2）：203-214.

［15］ Tang K F J，Navarro S A，Lightner D V. A PCR assay for discriminating between infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus （IHHNV） and the virus-related sequences in the genome of Penaeus monodon［J］. Dis Aquat Org，2007，74：165-170.

（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Test and Analysis of Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus on Penaeus monodon Imported from Thailand

Yu Li，Liu Ying，Zheng Xiaocong，Wang Jinjin，Jia Peng，He Junqiang，Liu Hong
（Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen，Guangdong 518045）

Abstract：In order to study the risks of Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus（IHHNV） of imported Penaeus monodon，PCR methods recommended by OIE manual（2015）were used to test IHHNV on 329 batches of Penaeus monodon imported from Thailand. The results showed that positive rate was 36.8%，and major genotypes were genotype 1 ，2 and unknown type with unclear risk. Therefore，the IHHNV risk of P. monodon imported from Thailand is high. Suggestions of reinforcing the surveillance of 1HHNV to control this disease and limit the negative effect on shrimp aquaculture of China were put forward.

Key words：IHHNV；Penaeus monodon；unknown genotype；risks

中圖分類號(hào)：S851.34

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-944X（2016）06-0083-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.06.024

基金項(xiàng)目：國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010IK007）

通訊作者：劉 葒