王昌建，鄒玖零，何世成，王衛(wèi)國，唐小明，林　源，魯杏華，邱立新（.湖南省動物疫病預防控制中心，湖南長沙　4004；.永州市動物疫病預防控制中心，湖南永州 45000）

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小反芻獸疫病毒熒光RT-PCR檢測方法的建立與應用

王昌建1，鄒玖零2，何世成1，王衛(wèi)國1，唐小明1，林源1，魯杏華1，邱立新1
（1.湖南省動物疫病預防控制中心，湖南長沙410014；2.永州市動物疫病預防控制中心，湖南永州 425000）

摘要：為建立小反芻獸疫病毒（PPRV）快速熒光RT-PCR檢測方法，應用DNAstar軟件對來自NCBI上的PPRV N基因序列進行比對分析，在保守區(qū)設置引物和探針，經(jīng)條件優(yōu)化，建立PPRV熒光RT-PCR檢測方法。結果顯示，該方法靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性強，陽性結果與商用試劑盒的檢測結果一致。結果表明該方法可用于PPRV的實驗室檢測。

關鍵詞：小反芻獸疫病毒；熒光RT-PCR；檢測

小反芻獸疫（Peste des Petits Ruminants，PPR）又稱小反芻獸假性牛瘟，病原為副粘病毒科麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒（PPRV）。該病毒主要感染小反芻獸，其中山羊和綿羊最易感，偶有野生動物感染［1］，目前未有人感染的報道。PPR一般發(fā)生在多雨、干燥、寒冷季節(jié)［2］。羊群發(fā)病率一般高達100%，嚴重時病死率可達100%，輕度發(fā)生時，病死率不超過50%［3］。PPRV可以通過直接接觸和空氣傳播［4］。

PPRV基因組為單股負鏈無節(jié)段RNA，有N-PM-F-H-L 6個基因［5］。其中N基因編碼N蛋白（核衣殼蛋白）。該蛋白的主要作用是保護病毒免受RNA核糖核酸酶的降解。傳統(tǒng)的病毒分離檢測方法耗時長，而瓊擴實驗及ELISA實驗，不僅靈敏度低，還無法區(qū)分PPRV和牛瘟病毒（RPV）。近年來，熒光RT-PCR分子生物學技術飛速發(fā)展，為PPR快速檢測提供了可能。本研究旨在建立一種快速、特異、準確、靈敏的PPRV熒光定量RT-PCR檢測方法。

1　材料與方法

1.1材料

PPR野毒為經(jīng)國家外來動物疫病研究中心確診的臨床陽性組織樣品；FMDV標準品為滅活后的FMDV病毒培養(yǎng)物，來自蘭州獸醫(yī)研究所；PPR弱毒苗（Nigeria75/1）為新疆天康畜牧生物技術股份有限公司產(chǎn)品；犬瘟熱疫苗為法國梅里亞公司產(chǎn)品；羊口瘡疫苗為山東泰豐生物技術有限公司產(chǎn)品。臨床樣品來自湖南各市州的20份臨床疑似PPRV組織病料樣品。

1.2主要試劑及儀器

核酸提取試劑盒（磁珠法），購自天隆科技；One Step PrimeScript RT-PCR Kit，購自TaKaRa -寶生物工程（大連）有限公司；PPRV一步法熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司；PPRV通用熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，購自國家外來動物疫病研究中心。其他儀器：ABI7500實時熒光PCR儀、天隆科技核酸提取儀、美國NANOVUE微量紫外分光光度計。

1.3病毒RNA提取

將組織樣品前處理后，用全自動核酸提取儀提取RNA核酸；用紫外分光光度計測RNA的濃度；將已知濃度的RNA，依次進行10倍梯度稀釋，共稀釋9個梯度，-70 ℃保存，作為模板備用。

1.4引物和探針的設計

將GenBank中已公布的PPRV N基因進行序列比較分析（表1），選擇保守序列，設計熒光RTPCR引物和Taqman探針，并用Blast比對引物和探針特異性后，送上海生工生物工程股份有限公司合成并標記。具體序列及擴增長度見表2。

表1　參考基因序列明細

表2　熒光RT-PCR引物和探針序列

1.5熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

參照TaKaRa公司的One Step PrimeScript RTPCR Kit說明書，以提取的RNA為模板，進行熒光定量RT-PCR反應。20 uL反應體系配制如下：2×buffer 10 uL，Ex TaqTM HS 0.4 uL，Prime Script RT Enzyme MixⅡ 0.4 uL，N-R1（20 uM）0.2 uL，N-F1（20 uM）0.2 uL，N-P1 （20 uM）0.4 uL，50×ROX 0.4 uL，RNA模板5 uL，補水至20 uL。反應條件：42 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。

1.5.1反應條件優(yōu)化。參照TaKaRa公司的One Step PrimeScript RT-PCR Kit說明書，以提取的RNA為模板進行熒光定量RT-PCR反應，對引物和探針濃度進行方陣實驗篩選最優(yōu)濃度，以獲得最小CT值和最大熒光信號為最佳濃度。

1.5.2靈敏度實驗。將10倍梯度稀釋的RNA，自高到低依次作為模板進行熒光定量RT-PCR反應，設立空白陰性對照，確定該方法的最低檢測濃度。

1.5.3重復性和穩(wěn)定性實驗。選取病毒RNA的10-3、10-4、10-5等3個梯度，在同一次反應中每個樣重復3次，進行組內(nèi)重復性實驗；每隔1周進行1次反應，共計3次，作為組間重復性實驗；兩組實驗均設陰性對照，并統(tǒng)計變異系數(shù)。

1.5.4特異性實驗。將分別提取的PPR野毒、PPR疫苗毒、FMDV、犬瘟熱疫苗毒及羊口瘡疫苗毒核酸作為模板進行特異性實驗，同時設立陰性對照。

1.5.5與普通RT-PCR的檢測靈敏度比較。選取100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等7個稀釋度，比較普通RT-PCR方法與本研究建立的熒光RTPCR方法的靈敏度。

1.5.6臨床樣品的檢測。對湖南部分地區(qū)送來的20份疑似PPRV病料組織提取RNA，用已經(jīng)建立的熒光定量RT-PCR方法進行檢測，并與實驗室商品試劑盒檢測方法比較各自檢出率。

2　結果

2.1反應體系的優(yōu)化

選用4、6、8 pmol/uL的引物和6、8、10 pmol/ uL的探針，用方陣法篩選反應的最佳引物和探針的搭配濃度。實驗結果表明，當引物為6 pmol/ uL、探針為8 pmol/uL時，有最小CT值和最佳擴增曲線。結果見圖1。

圖1　條件優(yōu)化擴增曲線

優(yōu)化后的反應程序如下：2×buffer 10 μL，Ex TaqTM HS 0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ 0.4 μL，N-F1（20 μM）0.3μL（6 pmol/ μL），N-R1（20 μM）0.3 μL（6 pmol/μL），N-P1（20 μM）0.4 μL（8 pmol/μL），50×ROX 0.4μL，RNA模板5 μL，補水至20 μL，反應條件：42 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。

2.2靈敏度實驗

對測得濃度為357.6 mg/L的RNA模板進行10倍梯度稀釋（10-1～10-9）后，進行熒光定量RT-PCR反應，結果表明該方法可以檢測到的最低稀釋度為10-6，即RNA濃度為357.6×10-6mg/L時也可以檢測到，其中稀釋度為10-7的檢測結果為可疑。結果見圖2。

圖2　敏感性擴增曲線

2.3重復性和穩(wěn)定性實驗

對10-3、10-4、10-5梯度，每個梯度重復3次，進行組內(nèi)重復性實驗。結果陰性對照未出現(xiàn)特異性擴增，同一梯度的擴增曲線重合性較好（圖3）。各梯度變異系數(shù)見表3，組間重復性實驗結果見表4。結果顯示該方法的重復性和穩(wěn)定性都較好，可以進行穩(wěn)定、可靠地檢測。

圖3　組內(nèi)重復性擴增曲線

表3　組內(nèi)重復性實驗

表4　組間重復性實驗

2.4特異性實驗

用本研究建立的PPR熒光定量RT-PCR方法對PPR野毒、PPR疫苗毒、FMDV、犬瘟熱疫苗毒及羊口瘡疫苗毒核酸進行檢測。結果顯示，該方法對PPR野毒和疫苗株，均可檢測出特異性擴增曲線，對其他病毒及陰性對照的檢測結果均為陰性，表明本研究建立的方法特異性好，可以用于通用型PPRV的檢測（圖4）。

圖4　特異性擴增曲線

2.5與普通RT-PCR方法的靈敏度比較

普通RT-PCR的檢測結果表明（圖5），稀釋度為10-4時有特異性條帶擴增，往后的稀釋度無特異條帶，說明該方法最低可以檢測到10-4稀釋度的RNA。而本研究建立的熒光定量RT-PCR可以檢測到10-6稀釋度的RNA，是普通RT-PCR檢測靈敏度的100倍。

2.6臨床樣品的檢測

用建立的熒光RT-PCR方法與兩種商用熒光RT-PCR檢測試劑盒，對20份臨床疑似PPR組織病料進行同時檢測。結果顯示，建立的熒光RT-PCR方法檢測結果中，有11個樣品為陽性，與兩種商用熒光RT-PCR檢測試劑盒的檢測結果一致，符合率為100%。

圖5　敏感性實驗

3　討論

經(jīng)過國內(nèi)外學者對PPR的廣泛研究，目前已建立了病毒分離、瓊脂免疫擴散實驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、RT-PCR及熒光RT-PCR等多種檢測PPR的方法［6-7］?；赑PR對我國的危害，建立靈敏、特異、快速、準確的PPR診斷方法，是防控該病的當務之急。聚合酶鏈式反應技術比其他檢測方法的特異性和靈敏度都要高，目前已廣泛應用于病原學的快速診斷。Forsyth 等首次建立了PPRV和RPV的RT-PCR 鑒別診斷方法；Couacy-Hymann［8］等建立了檢測PPRV的RT-PCR方法，但該方法分兩步進行，容易污染，且耗時長。Balamurugan［9］等建立了檢測PPRV的一步RT-PCR方法，解決了易污染和假陽性問題，但不能直接觀察實驗結果。國內(nèi)也有學者建立了RT-PCR方法對PPRV進行檢測。姚李四［10］等建立了一步RT-PCR方法檢測PPRV。毛立［11］設計了一對特異引物和一對內(nèi)參引物，建立了特異檢測PPRV的RT-PCR方法，但要通過電泳后觀察結果，且靈敏度不如熒光RT-PCR方法。包靜月［12］在普通RT-PCR的基礎上，通過設計引物和Taqman探針，建立了一步法實時熒光定量RT-PCR方法。該方法靈敏度高、特異性好，但耗時較長。本研究建立的熒光RT-PCR方法可在1 h內(nèi)得到檢測結果，適用于實驗室的快速檢測，但試劑組分過多，配置過程繁瑣易出錯。

本研究選擇N基因高度保守區(qū)設計探針，并在探針上下游設計引物，建立了檢測PPRV的一步熒光RT-PCR方法。設計的特異性探針與來自多個地區(qū)的PPRV毒株都匹配，探針的Tm值為69.5 ℃，比引物的Tm值高出約10 ℃，保證了探針在退火時先于引物與目的片段結合，且引物和探針都沒有二級結構，確保了反應的特異性和高效性。試驗發(fā)現(xiàn)，所建立的熒光RT-PCR方法特異性強，僅檢測到PPR疫苗毒和野毒，對FMDV、羊口瘡、犬瘟熱病毒均沒有擴增反應。重復性實驗和穩(wěn)定性實驗發(fā)現(xiàn)，變異系數(shù)均不超過5%，具有良好的重復性和穩(wěn)定性。對20份臨床疑似樣品檢測發(fā)現(xiàn)，本研究建立方法的檢測結果與世紀元亨公司及國家外來動物研究中心PPRV熒光RT-PCR檢測試劑盒一致，表明本研究建立的PPRV熒光RT-PCR方法可以有效檢測PPR，適合臨床應用。

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（責任編輯：朱迪國）

Establishment and Application of Fluorescence RT-PCR Detection Method for Peste des Petits Ruminants Virus

Wang Changjian1，Zou Jiuling2，He Shicheng1，Wang Weiguo1，Tang Xiaoming1，Lin Yuan1，Lu Xinghua1，Qiu Lixin1
（1.Hunan Animal Disease Prevention and Control Center，Changsha，Hunan 410014；2.Yongzhou Animal Disease Prevention and Control Center，Yongzhou，Hunan 425000）

Abstract：In order to establish a rapid fluorescence RT-PCR assay for detection of Peste des Petits Ruminants virus （PPRV），PPRV N gene sequences from NCBI were analyzed by DNAstar software. A pair of primers and a probe at the conservative site were designed. After optimization of conditions，the PPRV fluorescence RT-PCR detection method was established. The results showed that the method was of high sensitivity，good specificity and good stability. The results of positive samples were consistent with commercial kits，indicated that this method could be used for PPRV detection in laboratory.

Key words：PPRV；fluorescence RT-PCR；detection

中圖分類號：S852.695.5

文獻標識碼：A

文章編號：1005-944X（2016）06-0072-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.06.021

通訊作者：鄒玖零