胡　琦　譚小寧　余　娜　朱　沛　陳思勤　朱克儉

(湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長沙，410006)

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臭牡丹總黃酮介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡

胡琦譚小寧余娜朱沛陳思勤朱克儉

(湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長沙，410006)

摘要目的：探討臭牡丹總黃酮誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測臭牡丹總黃酮對細(xì)胞凋亡的影響；RT-PCR法檢測臭牡丹總黃酮作用于HepG2細(xì)胞48 h后對β-catenin、Tcf-4、CD44v6 mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：隨著臭牡丹總黃酮劑量的增加，細(xì)胞凋亡比例亦相應(yīng)增加。PT-PCR結(jié)果顯示不同劑量臭牡丹總黃酮作用下β-catenin、Tcf-4、CD44v6 mRNA的表達(dá)均降低，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：臭牡丹總黃酮誘導(dǎo)HepG2凋亡，能下調(diào)β-catenin、Tcf-4、CD44v6基因的表達(dá)，其作用機(jī)制可能與調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路并抑制其關(guān)鍵基因有關(guān)。

關(guān)鍵詞臭牡丹總黃酮；肝癌；Wnt/β-catenin信號通路；凋亡

肝癌是我國僅次于肺癌的第2大癌癥殺手。近年來中醫(yī)藥在我國的肝癌防治研究方面發(fā)揮著越來越重要且獨特的作用。臭牡丹是根據(jù)著名中醫(yī)藥學(xué)家歐陽锜研究員，發(fā)掘湖南民間治療惡性腫瘤單方，通過多年的反復(fù)臨床、科研實踐篩選出來并習(xí)用的一味中草藥。其性平，味辛、苦，具有健脾養(yǎng)血、解毒散瘀之效。前期研究表明，臭牡丹具有鎮(zhèn)痛、催眠、抑菌、抗炎及抗腫瘤的藥理作用[1]。其莖葉含有大量黃酮成分，目前分離出來的黃酮類化合物有明顯抗腫瘤活性[2-3]，但其抗腫瘤機(jī)制相關(guān)研究頗少。Wnt/β-catenin信號通路作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制涉及細(xì)胞凋亡等多方面。本研究選擇人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株為實驗對象，觀察臭牡丹總黃酮對HepG2細(xì)胞凋亡以及對Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路的影響，以從一定角度探討臭牡丹總黃酮抗肝癌的具體機(jī)制。

1材料

1.1藥物臭牡丹飲片湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所鑒定、提取。提取采用溶劑萃取法，取臭牡丹地上部分，加入10倍量蒸餾水煮沸20 min后過濾，剩余殘渣再用蒸餾水加熱提取，將兩次濾過液合并，濃縮后用3倍量95%乙醇靜置48 h后，減壓過濾并回收濾液中乙醇至無醇味。溶液依次使用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取乙酸乙酯提取液濃縮、干燥。干膏粉黃酮總含量65%，1 g相當(dāng)于生藥30 g。

1.2試劑DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；0.25%胰蛋白酶(美國Amresco公司)；胎牛血清(上海博谷生物科技有限公司)；MTT(德國biomol公司)；二甲基亞砜(德國biomol公司產(chǎn)品)；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)；Trizol(Invitrogen)。

1.3細(xì)胞人肝癌細(xì)胞株HepG2，由中南大學(xué)細(xì)胞中心提供，于湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中心實驗室傳代培養(yǎng)。

1.4設(shè)備超凈工作臺(上海凈化設(shè)備廠)；二氧化碳孵箱(德國Heraeus公司)；22R型低溫高速離心機(jī)(知信儀器)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；熒光定量PCR儀(Roche 480)。

2方法

2.1人肝癌細(xì)胞株HepG2的體外培養(yǎng)HepG2在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃，5% CO2條件下恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長情況，細(xì)胞匯合率達(dá)70%～80%，待細(xì)胞生長達(dá)飽和狀態(tài)時，進(jìn)行消化傳代，選擇對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

2.2藥物配制準(zhǔn)確稱取50 mg臭牡丹總黃酮，溶于2 mL二甲基亞砜(DMSO)溶液中，濾器過濾，得儲液為25 mg/mL。用完全培養(yǎng)基稀釋成工作濃度：10 μg/mL，25 μg/mL，40 μg/mL。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測臭牡丹總黃酮對HepG2細(xì)胞凋亡作用的影響實驗分為空白組，臭牡丹總黃酮低劑量組(10 μg/mL)、臭牡丹總黃酮中劑量組(25 μg/mL)、臭牡丹總黃酮高劑量組(40 μg/mL)，用不含EDTA的胰酶消化收集，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每次2 000 r/min離心5 min，收集約1～5×105細(xì)胞，加入500 μL的Binding buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻，室溫、避光，反應(yīng)5～15 min，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀觀察檢測細(xì)胞凋亡情況。

2.4熒光定量PCR檢測臭牡丹總黃酮對Wnt/β-catenin通路中關(guān)鍵因子β-catenin,Tcf-4,CD44v6基因表達(dá)的影響將空白組、低劑量組(10 μg/mL)、高劑量組(40 μg/mL)細(xì)胞收集，Trizol提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計測定提取的總RNA濃度，以組織總mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL(0.2 mL無酶PCR tube管)：1 μL RNA，1 μL Random primer，10 μL無菌DEPC處理水，70 ℃加熱5 min，迅速插入冰中冷卻。再依次加入：4 μL 5×Reaction buffer、2 μL dNTP、1 μL RNase inhibitor、37 ℃加熱5 min。再加入：1 μL M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200units)，42 ℃，1.5 h；72 ℃反應(yīng)10 min。所得cDNA于-20 ℃凍存。

SYBR法檢測基因表達(dá)，實時定量PCR(每個樣本每個指標(biāo)3個孔，共30 μL體系，每孔10 μL)體系組成：1 μL cDNA，0.5 μL Primer A(10uM)，0.5 μL Primer B(10uM)，15 μL 2X SYBGREEN PCR Master Mix，13 μL PCR H2O。反應(yīng)條件：95 ℃10 min，95 ℃ 10 s，59 ℃50 s，讀板，共40個循環(huán)。引物序列見下表1。

表1　引物序列

2.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量樣本采用t檢驗比較，不符合正態(tài)分布的樣本采用秩和檢驗；計數(shù)樣本采用秩和檢驗，構(gòu)成比之間比較用χ2檢驗，檢驗水平P<0.05。

3結(jié)果

3.1臭牡丹總黃酮對HepG2凋亡的影響流式細(xì)胞儀觀察結(jié)果顯示用不同濃度臭牡丹總黃酮干預(yù)后，細(xì)胞凋亡比例發(fā)生相應(yīng)變化，低、中、高劑量組的凋亡比例分別為：(16.33±4.73)%、(21.36±8.44)%、(15.42±13.48)%，其中中劑量臭牡丹總黃酮干預(yù)后凋亡比例最大，與正常對照組(5.84±2.33)%比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示臭牡丹總黃酮可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡(見圖1，圖2)。

3.2臭牡丹總黃酮對β-catenin、Tcf-4、CD44v6基因表達(dá)的影響β-catenin、Tcf-4、CD44v6及actin的實時熒光擴(kuò)增曲線圖提示擴(kuò)增曲線基本擬合較好，表明各組PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠；β-catenin、Tcf-4、CD44v6及actin的實時熒光溶解曲線圖均有單一主峰，且重復(fù)多次所得到的溶解溫度均值上下不超過1 ℃，表明擴(kuò)增產(chǎn)物具有特異性。

各組HepG2細(xì)胞β-catenin、Tcf-4和CD44v6 mRNA表達(dá)量，分析顯示總的組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)：與空白組比較，臭牡丹總黃酮高劑量組β-catenin、Tcf-4 mRNA的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.01)，低劑量組β-catenin、Tcf-4和CD44v6 mRNA的表達(dá)水平輕度下調(diào)(P<0.05)。提示臭牡丹總黃酮可降低β-catenin、Tcf-4和CD44v6 mRNA的表達(dá)水平(見圖3)。

圖1　流式細(xì)胞術(shù)檢測HepG2凋亡圖

圖2　不同劑量臭牡丹總黃酮對HepG2細(xì)胞凋亡率的影響

圖3　不同質(zhì)量濃度的臭牡丹總黃酮對HepG2細(xì)胞β-catenin、Tcf-4和CD44v6 mRNA的表達(dá)mRNA表達(dá)的影響

4討論

自1963年美國化學(xué)家瓦尼(M.C.Wani)和沃爾(Monre E.Wall)首次從太平洋杉(Pacific Yew)的樹皮和木材中分離到的紫杉醇粗提物對離體培養(yǎng)的鼠腫瘤細(xì)胞有較高活性開始，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對腫瘤治療理念的深入與改變，植物有效成分等天然藥物提取物越來越受到腫瘤學(xué)家與藥理學(xué)家的重視。

國內(nèi)外相關(guān)研究證實，臭牡丹具有良好抗腫瘤活性，且其不良反應(yīng)小，因此具有良好應(yīng)用前景。其莖葉含有大量黃酮成分，臭牡丹目前分離出來的黃酮類化合物具有明顯抗腫瘤活性。黃酮類發(fā)揮抗腫瘤作用主要通過以下途徑：對細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKS)產(chǎn)生抑制、對蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化過程進(jìn)行調(diào)節(jié)、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等[4-5]。

細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞主動性死亡模式，在腫瘤的形成和演變過程中起著重要的作用[6]。Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑作為與腫瘤密切相關(guān)的經(jīng)典通路，與人類多種癌癥的發(fā)病過程都密切相關(guān)。肝細(xì)胞癌的產(chǎn)生、發(fā)展與Wnt/β-catenin信號通路關(guān)系密切。Wnt/β-catenin信號通路影響細(xì)胞行為的作用主要和調(diào)節(jié)TCF家族的DNA結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄性質(zhì)有關(guān)，胞質(zhì)內(nèi)β-catenin表達(dá)穩(wěn)定是其核心。β-catenin作為通路中的關(guān)鍵因子，一方面其表達(dá)程度與肝癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，另一方面其可以激活下游轉(zhuǎn)錄因子4(Tcf-4)[7]基因和靶基因之一的CD44v6基因[8]調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期以及細(xì)胞黏附等腫瘤發(fā)生的多種機(jī)制。

本研究通過流式細(xì)胞檢測得出的臭牡丹總黃酮處理HepG2細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率明顯增加。不同濃度臭牡丹總黃酮分別干預(yù)HepG2細(xì)胞48 h后，發(fā)現(xiàn)隨藥物濃度的增加，β-catenin、Tcf-4、CD44v6表達(dá)下降程度越高，說明臭牡丹總黃酮可以抑制β-catenin的表達(dá)，進(jìn)而抑制相關(guān)因子Tcf-4和CD44v6轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮其抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，表明臭牡丹總黃酮抗肝癌HepG2的機(jī)制可能與阻礙Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。

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(2016-05-25收稿責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Research on the Medicate Effect of Clerodendron Bungei Flavornoids on Wnt/β-catenin in Inducing the Apoptosis of HepG2

Hu Qi,Tan Xiaoning,Yu Na,Zhu Pei,Chen Siqin,Zhu Kejian

(AffiliatedHospitalofHuNanAcademyofTraditionalChineseMedicine,Changsha410006,China)

AbstractObjective:To discuss the apoptotic effect of Clerodendron bungei flavornoids on liver tumor cells and the possible mechanism.Methods:To culture HepG2 cells in virto,and investigate the apototic effect of clerodendron bungei flavornoidson by flow cytometry.The mRNA expression levels of proteins β-catenin,Tcf-4 and CD44v6 of HepG2 tumor cells were detected by RT-PCR after 48h treatment of flavornoids.Results:Flow cytometry indicates that along with the rising dose of Clerodendron bungei flavornoids,the apoptosis rate of HepG2 cancer cells begin to grow.After 48h treatment of flavornoids,the mRNA expression levels of proteins β-catenin,Tcf-4 and CD44v6 of HepG2 tumor cells were down-regulated significantly,and compared with the control group,significant difference exist.Conclusion:Clerodendron bungei flavornoids can induce the apoptosis of HepG2 tumor cells and decrease the mRNA expression levels of proteins β-catenin,Tcf-4 and CD44v6.This might relate to its regulating effect on Wnt/β-catenin pathway and inhibit the key gene's expression.

Key WordsClerodendron bungei flavornoids; Liver cancer; Wnt/β-catenin pathway; Apoptosis

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(編號：81503452)

通信作者：譚小寧(1987—)，女，助理研究員，研究方向：中藥抗腫瘤成分及其作用機(jī)制；朱克儉(1955.12—)，男,研究員,研究方向:內(nèi)科疑難病證辨治方法,E-mail:0731zkjo@263.net

中圖分類號：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.06.004