付麗麗，金晶，吉美萍，那日，郭九峰

（內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特010021）

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靜電場對鈍頂螺旋藻的生物效應(yīng)

付麗麗，金晶，吉美萍，那日，郭九峰

（內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特010021）

摘要：為選育優(yōu)良的螺旋藻Spirulina platensis藻株，探究靜電場的生物學(xué)效應(yīng)，采用靜電場對鈍頂螺旋藻進(jìn)行處理，分別在0、3、6、9、12、15、18、21、24、27 kV電壓下處理藻株5 min，處理后的藻株依次記為IS、ES-1、…、ES-9，將藻株按照一定條件進(jìn)行培養(yǎng)后，對其生長速度、藻體上浮性、葉綠素a、丙二醛（MDA）、水溶性蛋白質(zhì)、藻藍(lán)蛋白質(zhì)含量和超氧化物歧化酶（SOD）比活性進(jìn)行測定。結(jié)果表明：與對照藻株IS株相比，處理組藻體MDA含量均有所降低；除ES-5藻株外，其他處理藻株的生長速度均明顯加快；ES-8藻株上浮性最好，其葉綠素a、水溶性蛋白質(zhì)、藻藍(lán)蛋白質(zhì)含量和SOD比活性較IS均有明顯增加，增幅分別為37.69%、19.13%、19.26%和7.06%；對ES-8株與IS株葉綠素a的紫外吸收光譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)ES-8株最大吸收峰值與IS株相比有明顯變化。研究表明，靜電場對鈍頂螺旋藻具有生物效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：鈍頂螺旋藻；靜電場；生物效應(yīng)

螺旋藻Spirulina platensis是一種具有重要開發(fā)應(yīng)用價(jià)值的自養(yǎng)原核生物，它具有光合效率高、生長繁殖快、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，是少數(shù)能大規(guī)模培養(yǎng)的微藻之一［1］。螺旋藻含有高蛋白質(zhì)、高維生素和豐富的生物活性物質(zhì)，現(xiàn)已開發(fā)成為保健食品和藥品。在螺旋藻工業(yè)化生產(chǎn)中，產(chǎn)量和質(zhì)量明顯受地區(qū)和環(huán)境因子的制約，各地均致力于篩選適合本地區(qū)生長繁殖、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品系，以提高產(chǎn)量、降低成本［2］。因此，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)螺旋藻藻種的篩選成為實(shí)際生產(chǎn)中一個(gè)重大課題［3］。利用物理誘變及相關(guān)技術(shù)可有效地解決螺旋藻對低溫適應(yīng)能力較差、藻種退化等問題。目前，關(guān)于激光、電磁波、磁場、微納米顆粒和微重力等物理因子對螺旋藻生物效應(yīng)的研究較多，但利用電場處理螺旋藻的相關(guān)研究較少。本研究中采用靜電場對鈍頂螺旋藻進(jìn)行處理，探索其生物學(xué)效應(yīng)，從中選育出優(yōu)良藻株，為進(jìn)一步優(yōu)化培育鈍頂螺旋藻提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)用藻種為鄂爾多斯高原鹽湖鈍頂螺旋藻，由鄂爾多斯市新宇力藻業(yè)集團(tuán)有限公司提供。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基和生長條件 試驗(yàn)用培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液 （Zarrouk培養(yǎng)液）和固體培養(yǎng)基 （在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入0.8%的瓊脂）。生長條件：日光燈3500 lx光照，溫度為26～28℃，光暗周期為12 h∶12 h。

1.2.2靜電場的處理 將藻體用超聲破碎成單細(xì)胞。破碎條件：250 W，處理時(shí)長3 s，間歇時(shí)長4 s，處理30次。取破碎后的藻液10 mL于底部半徑為8.8 cm的培養(yǎng)皿中進(jìn)行靜電場處理 （圖1）。處理?xiàng)l件為：將藻液分別在0、3、6、9、12、15、18、21、24、27 kV電壓下處理5 min，經(jīng)靜電場處理后的藻液樣品分別記為 IS、ES-1、ES-2、…、ES-9，然后將各樣品接入固體培養(yǎng)基中，放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：晝12 h、28℃；夜12 h、26℃。兩周后均已長出較長藻絲，此時(shí)移入標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液中培養(yǎng)。通過靜置分層分離法進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)［4］，并進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測定。

1.2.3生長速度和最終生物量的測定 定時(shí)取樣，用紫外可見分光光度計(jì)于560 nm處測定吸光度值，重復(fù)測定3次，取其平均值，繪制生長曲線。

圖1　電場處理裝置Fig.1 A device of electric field processing

從各組分別取100 mL藻液過濾，用純水清洗數(shù)次，于冷凍干燥機(jī)中干燥，稱量最終生物量。

1.2.4藻體上浮性測定 將生長狀態(tài)良好的螺旋藻培養(yǎng)液充分搖勻，靜置10 min和24 h后，分別取各培養(yǎng)瓶中下層液測定吸光度（A560 nm、A＇560 nm），重復(fù)測定3次，取其平均值［5］。計(jì)算公式為

其中：A、A＇分別為起始和終末時(shí)的吸光度值。

1.2.5葉綠素a含量的測定及其紫外吸收光譜掃描 取0.02 g藻干粉，加入6 mL提取液 （95%乙醇-95%丙酮），置入棕色瓶于冰箱 （4℃）中靜置過夜后，離心過濾，用紫外可見分光光度計(jì)在波長360～720 nm處掃描，再計(jì)算葉綠素 a含量（mg/mL）［6］：

1.2.6蛋白質(zhì)和丙二醛 （MDA）含量的測定 采用考馬斯亮藍(lán)G-250法，以牛血清白蛋白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。取0.03 g藻干粉，加入5 mL磷酸緩沖液，于冰箱 （4℃）中靜置過夜后，超聲破碎，離心取上清液，測定其蛋白質(zhì)含量。

于第20天時(shí)從各個(gè)處理樣品中提取新鮮藻體，制備提取液。取3 mL提取液加入2 mL 0.6%TBA，沸水中煮20 min，迅速冷卻、離心，取上清液用紫外可見分光光度計(jì)在波長450、532、600 nm處測量其吸光度A，計(jì)算MDA（μmol/L）含量［7］：

1.2.7藻藍(lán)蛋白質(zhì)和維生素C含量的測定 取螺旋藻粉0.03 g，加入6 mL磷酸緩沖液，超聲破碎后離心，去沉淀得上部溶液，向其中加入硫酸銨達(dá)到25%飽和度，去沉淀得上清液，上清液中加入硫酸銨達(dá)到55%飽和度，離心得沉淀，向沉淀中加入少量磷酸緩沖液溶解得藻藍(lán)蛋白質(zhì) （C-PC）粗酶液。用紫外可見分光光度計(jì)在波長620、650 nm處測量其吸光度，計(jì)算C-PC濃度 （mg/mL）：

由于藻體中所含VC具有還原性，對鄰苯三酚的自氧化速率有抑制作用，因此，對藻體破碎液中VC含量進(jìn)行測定時(shí)，采用2，6-二氯酚靛酚滴定法測定每毫升破碎液中VC的含量［8］。

1.2.8SOD活性的測定 采用鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性［9］。酶活力單位定義為：25℃ 1 mL反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%時(shí)的酶量為一個(gè)酶活力單位 （U）。

2　結(jié)果與分析

2.1靜電場對鈍頂螺旋藻生長速度的影響

由圖2可知，除ES-5藻株外，經(jīng)過靜電場處理的藻株均較對照藻株IS的生長速度明顯加快，其中ES-1株的生長速度最快，其次為ES-6、ES-8株，說明靜電場對藻體生長速度具有一定影響。

圖2　藻體的生長速度曲線Fig.2 Growth curve of the alga

2.2靜電場對鈍頂螺旋藻生物量的影響

由圖3可知，經(jīng)過靜電場處理的藻株生長20 d時(shí)的生物量，除ES-5株外其余藻株均比IS高，其中ES-1株的生物量最高，其次為ES-8、ES-6。

圖3　藻體的生物量Fig.3 Biomass of the alga

2.3靜電場對藻體上浮性的影響

藻絲浮性對藻絲調(diào)節(jié)其在水體中的位置非常重要，且在其養(yǎng)殖采收過程中也扮演著重要角色［10］。從表1可知，與對照藻株IS相比，經(jīng)過靜電場處理的藻株 （ES-3除外）上浮性均較好，說明靜電場處理可以大大改善藻體上浮性。其中ES-8株的上浮性最好，其上浮率達(dá)到76.59%，在采收過程中ES-8株更具有優(yōu)勢。

2.4藻體的葉綠素a、MDA含量

螺旋藻細(xì)胞中的色素積累是衡量螺旋藻藻株品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)。從表1可見：與對照藻株IS相比，經(jīng)過靜電場處理的藻株，除ES-4株外，其他藻株的葉綠素a含量均明顯增加，其中ES-8株的葉綠素a含量最高，其增幅為37.69%，其次為ES-1株，增幅為33.89%。這反映出ES-8藻株是具有較優(yōu)品質(zhì)的藻株。

從圖4可見，將較好的處理組ES-8與對照藻株IS葉綠素a的紫外吸收光譜相比較，最大吸收峰的位置一致，但ES-8株的最大吸收峰值明顯高于IS株，說明靜電場起到了一定作用。

植物器官衰老或在逆境下受傷害，往往發(fā)生膜脂過氧化作用，MDA是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，從膜上產(chǎn)生的位置釋放出后與蛋白質(zhì)、核酸起反應(yīng)修飾其特征，使纖維素分子間的橋鍵松弛，抑制蛋白質(zhì)的合成［11］。由此可見，低濃度MDA時(shí)蛋白質(zhì)的合成并不會(huì)受到抑制。從表1可見，經(jīng)靜電場處理的各組藻體MDA含量均低于對照藻株IS，其中ES-2株MDA含量最小，其次為ES-8株。

表1　藻體的上浮性、葉綠素a和丙二醛含量Tab.1 Floating rate and levels of Chl-a and MDA in the alga

圖4　葉綠素a的紫外吸收光譜Fig.4 Ultraviolet absorption spectra of Chl-a

2.5藻體的水溶性蛋白質(zhì)和藻藍(lán)蛋白質(zhì)含量

從表2可見：與對照藻株IS相比，除ES-4株外其他藻株的水溶性蛋白質(zhì)含量均有增加，其中ES-8株增幅最大，達(dá)到19.13%；而C-PC含量除ES-8、ES-9、ES-1株高于IS株外，其他藻株均低于IS株，其中ES-8株增幅最大，達(dá)19.26%。

表2　藻體的水溶性蛋白質(zhì)和藻藍(lán)蛋白質(zhì)含量Tab.2 Water-soluble protein and phycocyanin contents of the alga

2.6藻體的VC含量和SOD比活性

從表3可見：除ES-3株的VC含量超出300 μg/g外，其他藻株均小于300 μg/g，這表明，VC含量對SOD活性檢測影響不大；經(jīng)過靜電場處理后的藻株除ES-8、ES-1株的SOD比活性高于IS株外，其他藻株的SOD比活性均低于IS株。

表3　藻體的VC含量和SOD比活性Tab.3 Content of VC and SOD specific activity of the algae

3　討論

本研究中采用不同電壓下的靜電場對螺旋藻進(jìn)行處理，再通過靜置分層分離法將處理后的藻液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。結(jié)果表明，經(jīng)靜電場處理的藻株（ES-5株除外）的生長速度均比對照藻株IS快，而MDA含量均低于對照藻株。從中篩選出的優(yōu)質(zhì)藻株ES-8與IS株比較，其葉綠素a含量的增幅高達(dá)37.69%，水溶性蛋白質(zhì)含量增加19.13%，CPC含量增加19.26%，SOD比活性增加7.06%。藻株ES-8的葉綠素a含量、蛋白質(zhì)含量、藻藍(lán)蛋白質(zhì)含量的增幅均明顯高于有關(guān)報(bào)道［2，12］，達(dá)到了理想的效果。本試驗(yàn)中，經(jīng)過靜電場處理的藻株大多生長速度明顯加快，并且測得的葉綠素a含量也相應(yīng)有較大增幅。提高植物葉片內(nèi)葉綠素的含量，可促進(jìn)植物的光合作用，光合作用為植物生長發(fā)育提供物質(zhì)和能量，從而又影響到其他生理指標(biāo)的變化［13］。靜電場處理對螺旋藻的作用效果與對高等植物相似，因此，可認(rèn)為葉綠素a含量增加就是促進(jìn)藻體生長的因素之一。同時(shí)，通過葉綠素a的紫外吸收光譜可知，經(jīng)靜電場處理后的藻株ES-8最大吸收峰值明顯高于對照藻株IS，但峰值位置卻沒有發(fā)生變化，也就是說靜電場促進(jìn)了藻體葉綠素a的合成，但未改變其分子結(jié)構(gòu)。葉綠素a含量變化的原因，可能是靜電場處理引起了螺旋藻體內(nèi)代謝過程的變化所產(chǎn)生的。SOD活力越高，分解氧化產(chǎn)物的能力越強(qiáng)，從而可保護(hù)機(jī)體免受惡劣環(huán)境的傷害，對環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)性［14］。MDA是生物體在逆境條件下發(fā)生膜脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物之一。本研究中，ES-8株的蛋白質(zhì)含量、SOD酶比活性均有明顯增加，MDA含量相對較低。綜上所述，靜電場對鈍頂螺旋藻具有生物效應(yīng)，經(jīng)靜電場24 kV處理5 min可選育出優(yōu)質(zhì)的藻株ES-8。

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中圖分類號：Q177

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.03.014

文章編號：2095-1388（2016）03-0307-04

收稿日期：2015-08-09

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 （50267014）

作者簡介：付麗麗 （1989—），女，碩士研究生。E-mail：359654412@qq.com

通信作者：那日 （1955—），男，教授。E-mail：nari6363@sina.com

Biological effects of electric field on green alga Spirulina platensis

FU Li-li，JIN Jing，JI Mei-ping，NA Ri，GUO Jiu-feng
（Key Laboratory of Ion Beam Bioengineering in Inner Mongol Autonomous Region，Inner Mongolia University，Hohhot 010021，China）

Abstract：The growth，floating，specific activity of superoxide dismutase（SOD）and levels of malondialdehyde，water-soluble protein and Chl-a were determined in green alga Spirulina platensis named IS，ES-1，…，ES-8 and ES-9 exposed to electric field for 5 mins at 0，3，6，9，12，15，18，21，24 and 27 kV to evaluate the biological effects of electric field on green the alga.The results showed that there was less malondialdehyde content in the treated strains than in the original strain IS.However，the treated strains had better growth than the original strain IS except for ES-5，with the best floating in ES-8，and the contents of chlorophyll，water-soluble protein and phycocyanin increased by 37.69%，19.13%and 19.26%，respectively and the SOD specific activity increased by 7.06%.The ultraviolet absorption spectrum of Chl-a was shown to be significant variation in peak in ES-8 compared with the original strain，showing the biological effects of electrostatic field on green alga Spirulina platensis.

Key words：Spirulina platensis；electric field；biological effect