韓曉珂　　梁朝鋒　　祁　俊

安徽省蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，安徽蕪湖　241000

十七味大活血膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

韓曉珂梁朝鋒祁俊

安徽省蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，安徽蕪湖241000

目的建立十七味大活血膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法顯微法對(duì)延胡索進(jìn)行鑒別；薄層色譜法對(duì)三七、大黃進(jìn)行鑒別；HPLC法測(cè)定丹酚酸B、苦杏仁苷的含量。丹酚酸B色譜條件為：以C18為色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸溶液（22∶78）；檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm；苦杏仁苷色譜條件為：以C18為色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-水（20∶80）；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。結(jié)果 顯微鑒別粉末特征明顯；薄層鑒別斑點(diǎn)清晰，陰性無干擾；丹酚酸B在17.23～172.3 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=1），平均回收率為97.9%，RSD為1.1%；苦杏仁苷在11.04～110.38 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9998），平均回收率為100.1%，RSD為1.5%。三批樣品中兩種成分的平均含量分別為1.57、0.41 mg/粒。結(jié)論該法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單，適用于十七味大活血膠囊的質(zhì)量控制。

十七味大活血膠囊；顯微鑒別；薄層色譜；丹酚酸B；苦杏仁苷

［Abstract］Objective To estab1ish the qua1ity contro1 of Shiqiweidahuoxue Capsu1es.Methods The microscopica1 identification was adopted to ana1yze rizoma coryda1is.TLC method was used to identity radix notoginseng and rhubarb.The contents of s1viano1ic acid B and amygda1in were determined by HPLC method.Sviano1ic acid B was separated on C18co1umn with acetonitri1e-0.1%formic acid so1ution（22∶78）as mobi1e phase，detection wave1ength was 286 nm.Amygda1in was separated on C18co1umn with methano1-water（20∶80）as mobi1e phase，detection wave1ength was 210 nm. Results Microscopic identification had powder characteristics of Rhizoma Coryda1is.The spots were c1ear without interference in the b1ank reference.The 1inear ranges of sa1viano1ic acid B and amygda1in were 17.23-172.3 μg/mL（r=1），and 11.04-110.38 μg/mL（r=0.9998）.The average recoveries of sa1viano1ic acid B and amygda1in were 97.9%（RSD= 1.1%），and 100.1% （RSD=1.5%）.Two average contents of 3 batches of samp1es were 1.57 mg/grain，0.41 mg/grain. Conclusion The method is accurate and simp1e，which can be used for the qua1ity contro1 of Shiqiweidahuoxue Capsu1es.

［Key words］Shiqiweidahuoxue Capsu1es；Microscopica1 identification；TLC；Sa1viano1ic acid B；Amygda1in

社會(huì)進(jìn)步、交通發(fā)達(dá)、老齡化進(jìn)程等因素使骨折的發(fā)生率逐年增加。骨折患者在早期常會(huì)發(fā)生肢體腫脹現(xiàn)象，使患肢無法得到充足的血液和營(yíng)養(yǎng)供給［1］。如不及時(shí)處理，則引起組織康復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)、骨痂生長(zhǎng)緩慢等情況［2］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨傷初期及術(shù)后腫脹是由于外力損傷脈絡(luò)，血溢脈外，滯留皮肉筋骨，使氣機(jī)失調(diào)，津液輸布受阻，水溢脈外，留滯在肌膚腠理之間，表現(xiàn)為腫脹［3］。在整個(gè)治療過程中，中醫(yī)治療有明顯的療效，發(fā)揮著越來越大的作用［4-7］。

本方由丹參、茯苓、牡丹皮、當(dāng)歸、白茅根、赤芍、紅花、川芎、黃柏、延胡索、薏苡仁、車前子、桃仁、大黃、土鱉蟲、三七、陳皮組成，具有活血化瘀、消腫止痛作用，用于骨傷及手術(shù)后肢體腫脹、疼痛。為了控制本制劑的質(zhì)量，對(duì)延胡索進(jìn)行了顯微鑒別，對(duì)延胡索、三七、大黃進(jìn)行了薄層色譜鑒別，對(duì)丹酚酸B、苦杏仁苷含量進(jìn)行了HPLC測(cè)定。建立了簡(jiǎn)便、有效的質(zhì)量控制方法。

1　儀器與材料

高效液相色譜儀（Waters 2695，Agi1ent1200）；梅特勒XP-205電子天平；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；雙目顯微鏡（XDS-300C，上海蔡康光學(xué)儀器有限公司）；丹酚酸B（111562-201212）；苦杏仁苷（110820-201305）；延胡索對(duì)照藥材（120928-201208）；三七對(duì)照藥材（120941-201108）；大黃對(duì)照藥材（120902-201010）；硅膠G（H）板（青島海洋化工廠分廠）；乙腈、甲醇（HPLC/Spectro，TEDIA Company）；水為超純水（自制）；其他試劑均為分析純。樣品由蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供；對(duì)照品及對(duì)照藥材均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2　方法與結(jié)果

2.1顯微鑒別

延胡索顯微特征：下皮后壁細(xì)胞多角形、類方形或長(zhǎng)條形，壁稍彎曲，木化，有的成連珠狀增厚，紋孔細(xì)密。有螺紋導(dǎo)管［8］。見圖1。

圖1　十七味大活血膠囊中延胡索粉末顯微圖

2.2薄層色譜鑒別

2.2.1三七取本品內(nèi)容物4 g，加水飽和的正丁醇40 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液加3倍量正丁醇飽和的水，搖勻，放置使分層，取正丁醇層，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取三七對(duì)照藥材0.5 g，加水5滴，攪勻，再加以水飽和的正丁醇5 mL，振搖10 min，放置2 h，離心，取上清液，加3倍量正丁醇飽和的水，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取上述溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水 （15∶4∶22∶10）10℃放置的下層溶液為展開劑展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。見圖2。

圖2　三七薄層鑒別色譜圖

2.2.2大黃 取本品內(nèi)容物3 g，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，再加鹽酸2 mL，置水浴加熱回流30 min，立即冷卻，加乙醚萃取兩次，每次20 mL，合并乙醚提取液，蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。另取大黃對(duì)照藥材0.3 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取上述對(duì)照藥材溶液3 μL、供試品溶液5 μL，點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以石油醚 （60℃～90℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。見圖3。

圖3　大黃薄層鑒別色譜圖

2.3丹酚酸B的HPLC法測(cè)定

2.3.1色譜條件 色譜柱：Agi1ent Zorbax SB-C18（4.6 mm× 150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸溶液（22∶78）；檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm。理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.3.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B適量，加甲醇制成每毫升含90 μg的溶液，即得。

2.3.3供試品溶液的制備 精密稱定內(nèi)容物約1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷稱定重量，用75%甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，濾過，即得。

2.3.4陰性溶液的制備 按照處方工藝，取除丹參外的其余飲片制成陰性制劑，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制成陰性溶液。

2.3.5專屬性試驗(yàn)取上述三種溶液各10 μL，注入液相色譜儀測(cè)定［9-13］，結(jié)果陰性無相應(yīng)的色譜峰。見圖4。

圖4 十七味大活血膠囊丹酚酸B的HPLC圖譜

2.3.6方法學(xué)考察 丹酚酸B在17.23～172.3 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=12.902X-21.617，r2=1；取供試液，重復(fù)進(jìn)樣6次，RSD為0.22%，表明精密度良好；取供試液，分別于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣，RSD為0.59%，表明供試液穩(wěn)定性良好；取本品，按照“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品，6份，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果丹酚酸B的平均含量為4.3785 mg/g，RSD為0.25%，表明重復(fù)性良好。

2.3.7加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已測(cè)定含量的樣品6份，置具塞錐形瓶中，精密加入丹酚酸B對(duì)照品溶液（精密稱取丹酚酸B 17.18 mg，以95.4%計(jì)，置50 mL量瓶中，加75%甲醇溶解定容至刻度，搖勻，即得0.3278 mg/mL的對(duì)照品溶液）6.5 mL，按“2.3.3”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定，結(jié)果平均回收率為97.9%，RSD為1.1%，加樣回收率結(jié)果符合要求。見表1。

表1　丹酚酸B加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.8樣品測(cè)定 按“2.3.3”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定樣品中丹酚酸B的含量。結(jié)果見表3。

2.4苦杏仁苷的HPLC法測(cè)定

2.4.1色譜條件 色譜柱：Waters XBridge C18（4.6 mm× 150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（20∶80）；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；柱溫30℃。理論板數(shù)按苦杏仁苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000［14-26］。

2.4.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取苦杏仁苷適量，加甲醇制成每毫升含50 μg的溶液，即得。

2.4.3供試品溶液的制備 取內(nèi)容物約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，濾過，即得。

2.4.4陰性溶液的制備 按照處方工藝，取除桃仁外的其余飲片制成陰性制劑，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制成陰性溶液。

2.4.5專屬性試驗(yàn) 取上述三種溶液各10 μL，注入液相色譜儀測(cè)定，結(jié)果陰性無相應(yīng)色譜峰。見圖5。

圖5　十七味大活血膠囊苦杏仁苷的HPLC圖譜

2.4.6方法學(xué)考察苦杏仁苷在11.04～110.38 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=10 250X+1693，r2=0.9996；取供試液，重復(fù)進(jìn)樣6次，RSD為0.34%，表明精密度良好；取供試液，分別于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣一次，RSD為2.94%，表明穩(wěn)定性良好；取本品，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品6份，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算苦杏仁苷的平均含量為1.1532 mg/g，RSD為1.07%，表明重復(fù)性良好。

2.4.7加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)定含量的樣品6份，置具塞錐形瓶中，精密加入苦杏仁苷對(duì)照品溶液（濃度為0.5519 mg/mL）2 mL，按“2.4.3”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定，結(jié)果平均回收率為100.1%，RSD為1.5%。加樣回收率結(jié)果符合要求。見表2。

表2　苦杏仁苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4.8樣品測(cè)定按“2.4.3”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定樣品中苦杏仁苷的含量。結(jié)果見表3。

表3　三批樣品含量測(cè)定（mg/粒）

3　討論

在薄層色譜方法摸索過程中，對(duì)陳皮、當(dāng)歸、川芎、牡丹皮、黃柏、赤芍進(jìn)行了考察，結(jié)果樣品斑點(diǎn)不清晰或者有干擾；在含量測(cè)定過程中，曾嘗試對(duì)鹽酸小檗堿進(jìn)行測(cè)定，但陰性有干擾，故均未將其納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文中。

在測(cè)定丹酚酸B含量的過程中，對(duì)提取溶劑（甲醇、75%甲醇、乙醇）和提取方法（回流、超聲）分別進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)75%甲醇的提取率遠(yuǎn)高于甲醇和乙醇，提取方式對(duì)其影響不明顯?？紤]到超聲法的簡(jiǎn)便性和能源保護(hù)，選用超聲法提取。

在測(cè)定苦杏仁苷含量的過程中，使用丹酚酸B的樣品進(jìn)樣其峰響應(yīng)值不夠，故兩種含量提取方法未能統(tǒng)一。在以后的研究中，可以找到兩個(gè)指標(biāo)性成分的最佳提取點(diǎn)，使用同一個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定，以此更加簡(jiǎn)便地控制制劑的質(zhì)量。

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Quality control of Shiqiweidahuoxue Capsules

HAN XiaokeLIANG ChaofengQI Jun
Preparation Room，Wuhu Hospita1 of TCM，Anhui Province，Wuhu241000，China

R927.2

A

1673-7210（2016）04（c）-0147-05

韓曉珂（1981-），女，碩士，主要從事中藥制劑的開發(fā)研究。

2016-01-04本文編輯：趙魯楓）