石教啟　　伍昌林　　朱　亦　　張繼華　　黨鑫堂　　周雪敏　　佘吉佳

1.湖北省陽新縣人民醫(yī)院檢驗科，湖北陽新　435200；2.廣東省深圳市第二人民醫(yī)院檢驗科，廣東深圳　518035

Tfh/Treg/Breg細胞與習慣性流產患者免疫紊亂的關系

石教啟1伍昌林2▲朱亦2張繼華1黨鑫堂2周雪敏2佘吉佳2

1.湖北省陽新縣人民醫(yī)院檢驗科，湖北陽新435200；2.廣東省深圳市第二人民醫(yī)院檢驗科，廣東深圳518035

目的探討CD4+CXCR5+T（Tfh）、CD4+CD25+FoxP3+T（Treg）及CD1d（hi）CD5+CD19+B（Breg）細胞與習慣性流產（HA）患者兔疫紊亂的關系。方法從2014年5月～2015年9月在廣東省深圳市第二人民醫(yī)院產檢確診的孕婦中，隨機選擇30例流產次數(shù)≥2次的女性作為HA病例組，同時選擇30例正常懷孕生產的女性作為對照組。分別采集兩組孕婦懷孕期間外周血，分離外周血單核細胞（PBMC），采用流式細胞術檢測Tfh/Treg/Breg細胞數(shù)量及比例；采用酶聯(lián)兔疫吸附試驗測定血清中白細胞介素-21（IL-21）、白細胞介素-10（IL-10）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）的水平，及IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值變化，并分析IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值變化與流產次數(shù)的相關性。結果與對照組比較，HA病例組Tfh/Th、Tfh/Treg、Tfh/Breg細胞比值均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而Treg/Th、Breg/B細胞的比值均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與對照組比較，HA病例組IL-21升高（P＜0.05），而IL-10、TGF-β1均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值均升高（P＜0.05）。Spearman相關性分析結果顯示，IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值變化與HA病例組流產次數(shù)呈正相關（（r=0.786、0.694，均P＜0.05））。結論Tfh/Treg/Breg細胞及相關因子IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值變化可能與HA患者兔疫紊亂機制相關。

習慣性流產；Tfh/Treg/Breg細胞；IL-21/IL-10；IL-21/TGF-β1

［Abstract］Objective To exp1ore the re1ation between CD4+CXCR5+T（Tfh），CD4+CD25+FoxP3+T（Treg），CD1d（hi）CD5+CD19+B（Breg）subsets and the immune disorder of patients with habitua1 abortion（HA）.Methods From May 2014 to September 2015，30 pregnant women with two times or more abortion in the Second Peop1e's Hospita1 of Shenzhen City were random1y se1ected as HA case group，and 30 cases of norma1 pregnancy women were random1y se1ected as contro1 group.The periphera1 b1ood in two groups were co11ected during pregnancy.The Tfh，Treg and Breg subsets of the periphera1 b1ood of pregnant women in the two groups were ana1yzed by f1ow cytometry with immunof1uorescent staining. The 1eve1s of the periphera1 b1ood IL-21，IL-10 and TGF-β1were detected by ELISA assays，the re1ation between the ratios of the IL-21/IL-10，IL-21/TGF-β1and the abortion times were ana1yzed.Results Compared with the contro1 group，ratios of Tfh/Th，Tfh/Treg and Tfh/Breg were increased in HA case group，the difference was statistica11y significant（P＜0.05），and the ratios of Treg/Th，Breg/B ce11s were decreased，the differences were statistica11y significant（P＜0.05）.Compared with the contro1 group，IL-21 1eve1 was increased in HA case group（P＜0.05），but 1eve1s of IL-10 and TGF-β1were decreased，the differences were statistica1 significance（P＜0.05）.The ratios of IL-21/IL-10，IL-21/TGF-β1were increased（P＜0.05）.Besides，the Spearman corre1ation ana1ysis showed that，there was positive corre1ation between the ratio of IL-21/IL-10，IL-21/TGF-β1and the number of abortions in HA case group（r=0.786，0.694，a11 P＜0.05）.Conclusion The changes of Tfh/Treg/Breg in periphera1 b1ood and IL-21/IL-10，IL-21/TGF-β1ratios may re1ated to the immune disorder of patients with HA.

［Key words］Habitua1 abortion；Tfh/Treg/Breg ce11；IL-21/IL-10；IL-21/TGF-β1

習慣性流產（habitua1 abortion，HA）是自然流產連續(xù)發(fā)生2～3次甚至更多，且每次流產均集中在同一個妊娠月份，懷孕周數(shù)不足20周的情況下妊娠中止，其發(fā)病機制復雜，可能與兔疫性因素、感染性因素、內分泌性因素和解剖因素等有關。近年研究發(fā)現(xiàn)HA的發(fā)生發(fā)展與CD4+Th17及調節(jié)性T細胞（Treg）的分化狀態(tài)有關［1-3］，但Tfh/Treg/Breg（濾泡輔助性T細胞/Treg/調節(jié)性B細胞）的兔疫平衡在HA患者中的作用尚不明確。本研究將分離HA病例及正常孕婦外周血單個核細胞，采用流式細胞術（FCM）測定Tfh/Treg/Breg細胞的表達；酶聯(lián)兔疫吸附試驗（ELISA）分析HA及正常孕婦血清中相應的細胞因子白細胞介素-21（IL-21）、白細胞介素-10（IL-10）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）的水平，及IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值變化，探討Tfh/Treg/Breg細胞在HA患者兔疫紊亂中的作用，為HA的臨床診斷與治療提供新思路。

1　資料與方法

1.1一般資料

研究對象的納入標準：經(jīng)過B超檢查確定的懷孕女性，其中HA患者為自然流產2次或2次以上的女性，健康對照組為懷孕后并正常生產的女性。排除經(jīng)檢查排除了其他相關的自身兔疫性疾病。從2014年5月～2015年9月廣東省深圳市第二人民醫(yī)院門診與住院部檢查的孕婦中，隨機選擇了30例懷孕后并正常生產的女性作為健康對照組，年齡26～45歲，中位年齡30歲；隨機選擇30例自然流產2次及2次以上女性作為HA病例組，年齡23～44歲，中位年齡29歲，均符合HA的診斷標準［3］。兩組一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)廣東省深圳市第二人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，參與研究者均知情同意。

1.2試劑與儀器

流式細胞儀（美國，BD公司），酶標儀（中國，匯松MB-580），IL-21、HA10、TGF-β1的ELISA試劑盒（美國，R&D公司）。FITC標記抗人-FoxP3、PercP標記抗人-CD4、FITC標記抗人-CD25 mAb、FITC標記抗人-CXCR5的單克隆抗體及它們對照的同型對照抗體（美國，Mi1tenyibiotec公司）；檢測Breg需要的PECD1d、FITC-CD5、PerCP-CD19抗體及同型對照IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PerCP抗體（美國，BD公司）。

1.3檢測方法

1.3.1外周血單核細胞的分離 根據(jù)密度梯度離心法，由Fico11細胞分離液分離外周血單核細胞（PBMC），PBS與全血按1∶1比例稀釋后，在常溫下，以2000 r/min離心15 min，PBS洗滌細胞，調整細胞濃度為1×109/L，供流式細胞儀檢測細胞亞群，同時收集上清供細胞因子檢測。

1.3.2流式細胞術檢測外周血Tfh、Treg、Breg細胞比例 ①外周血Tfh細胞的檢測：取兩支試管，分別為實驗管和同型對照管，其中一支分別加入PercP標記的抗人CD4 mAb與FITC標記的抗人CXCR5 mAb 各10 μL，混勻，同時設立同型對照，避光放置30 min，洗滌2次，重懸細胞后上機檢測。②外周血Treg的檢測：另取兩支試管，其中一支加入FITC標記的抗人FoxP3抗體、PercP標記的抗人CD4 mAb和FITC標記的抗人IL-25 mAb各10 μL，同樣對照管加入同型對照抗體，避光30 min后，洗滌2次，重懸細胞后上機檢測。③分別取4支試管，取上述淋巴細胞分層液分離單個核細胞，PBS洗2次，計數(shù)，各取106個單個核細胞，第一支試管同型對照，加入IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PerCP抗體分別5 μL；第二支試管加入PerCP-CD19抗體5 μL；第三支試管加入FITC-CD5、PerCP-CD19抗體各5 μL；第四支試管加入PE-CD1d、FITC-CD5、PerCP-CD19抗體各5 μL；將標本與抗體充分混勻后，室溫避光孵育1 h。離心后棄上清，用PBS洗2遍，上流式細胞儀檢測，相關檢測結果運用軟件分析比較。

1.3.3HA患者外周血IL-21、IL-10、TGF-β1的檢測按照ELISA試劑盒提供的說明書進行。取已收集凍存的血清，溶解處理后每個樣本和標準品均設復孔檢測，酶標儀在520 nm波長處讀取OD值，由標準品在配套軟件上自動繪制標準曲線，并獲得各個待測樣本上清中細胞因子IL-21、IL-10、TGF-β1含量。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用X2檢驗，兩變量間的相關性用Spearman相關分析法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1兩組外周血細胞Tfh/Treg/Breg細胞亞群的比較

經(jīng)過流式細胞儀測定結果顯示：HA病例組患者外周血中CD4+T細胞中Tfh/Th的比例升高，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Treg/Th、Breg/B ce11的比例降低，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而Tfh/Treg、Tfh/Breg細胞的比值升高，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1　兩組外周血細胞Tfh/Treg/Breg細胞亞群的比較（%，±s）

表1　兩組外周血細胞Tfh/Treg/Breg細胞亞群的比較（%，±s）

注：HA：習慣性流產；Tfh：濾泡輔助性T細胞；Treg：調節(jié)性T細胞；Breg：調節(jié)性B細胞

對照組HA病例組t值P值30 30 11.43±1.22 22.63±2.51 16.09 ＜0.05 4.27±1.32 2.10±0.29 8.37 ＜0.05 2.70±0.28 1.10±0.22 7.60 ＜0.05 2.67±0.92 10.78±8.66 5.10 ＜0.05 7.10±4.41 16.10±6.29 8.78 ＜0.05組別　　例數(shù)　Tfh/Th　Treg/Th　Breg/B ce11　Tfh/Treg　Tfh/Breg

2.2兩組外周血細胞因子IL-21、IL-10、TGF-β1水平比較

ELISA法測得HA病例組PBMC上清中IL-21、IL-10、TGF-β1水平，與對照組比較，IL-21水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而IL-10、TGF-β1的水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2　兩組外周血細胞因子IL-21、IL-10、TGF-β1水平比較（pg/mL，±s）

注：HA：習慣性流產；IL-21：白細胞介素-21；IL-10：白細胞介素-10；TGF-β1：轉化生長因子-β1

對照組HA病例組t值P值30 30 51.39±13.95 74.85±18.26 3.23 ＜0.05 43.14±11.26 26.54±8.71 4.87 ＜0.05 254.13±45.16 126.35±13.62 6.94 ＜0.05組別　　例數(shù)　IL-21　IL-10　TGF-β1

2.3兩組外周血IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值比較

與對照組比較，HA病例組外周血中IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；流產次數(shù)＞3次的HA病例組IL-21/IL-10、IL-21/ TGF-β1比值顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而流產次數(shù)2～3次的HA病例組IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值低于流產次數(shù)＞3次的HA病例組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3　兩組外周血IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值比較（pg/mL，±s）

表3　兩組外周血IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值比較（pg/mL，±s）

注：與對照比較，*P＜0.05；與流產次數(shù)2～3次的HA病例組比較，#P＜0.05；IL-21：白細胞介素-21；IL-10：白細胞介素-10；TGF-β1：轉化生長因子-β1

對照組HA病例組流產次數(shù)2～3次流產次數(shù)＞3次30 30 17 13 1.19±1.23 2.82±2.09*1.76±1.08*3.15±1.76*#0.20±0.31 0.59±1.34*0.38±0.87*0.84±0.92*#組別　　例數(shù)　IL-21/IL-10　IL-21/TGF-β1

2.4IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值與流產次數(shù)的相關性分析

Spearman相關性分析結果顯示，IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值與HA患者的流產次數(shù)呈正相關（r=0.786、0.694，均P＜0.05）。

3　討論

HA是指連續(xù)自然流產3次及3次以上的患者，近年常用復發(fā)性流產取代HA，改為2次及2次以上的自然流產。近年研究發(fā)現(xiàn)HA的發(fā)生發(fā)展與機體兔疫功能狀態(tài)密切相關，而CD4+T細胞在機體自身兔疫平衡中發(fā)揮重要作用，效應T細胞與Treg的失衡可能與一些自身兔疫病的發(fā)生相關。HA是一種由自身兔疫抗體引起的多因素參與的疾病，已證實HA患者外周血Th17細胞功能亢進，而Treg細胞分化低下，在體內存在針對自身抗原的自身抗體，其發(fā)病機制復雜［4-7］。但有關CD4+效應Tfh細胞與Treg、Breg在HA體內變化研究較少，且Tfh/Treg/Breg細胞平衡狀態(tài)尚不明確。

近年研究表明，濾泡輔助性T細胞 （T fo11icu1ar he1per ce11s，Tfh）是一群CD4+效應性T細胞亞群，在兔疫應答中輔助B細胞產生抗體［8-10］，主要通過IL-21發(fā)揮作用，表型為CD4+CXCR5+；在小鼠模型中，阻斷Tfh應效分子IL-21等，可導致自身抗體下降［11-13］，表明Tfh細胞異?？赡芘c自身兔疫性疾病的發(fā)病密切相關。Treg是一類抑制體內自身兔疫反應性的CD4+Treg，其表型主要為FoxP3+CD4+CD25+，與其兔疫調節(jié)功能密切相關的因子為IL-10等，其異常表達可導致自身兔疫性疾病發(fā)生［8］。那么效應Tfh細胞與調節(jié)性Treg細胞的平衡可能與自身兔疫病的發(fā)生發(fā)展相關。HA患者發(fā)生機制復雜，而Tfh細胞可輔助B細胞產生高親和力自身抗體，而Treg細胞則可抑制自身抗體的產生，本研究推測Tfh/Treg細胞平衡可能參與介導了HA自身抗體的產生及其兔疫機制［9-10］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，表型為CD1d（hi）CD5+CD19+的Breg是一種新型的具有負向調節(jié)功能的B細胞，其數(shù)量和功能的異常也可能是自身兔疫病發(fā)生的重要機制［14-16］。調節(jié)性Breg可通過抑制自身反應性Th細胞而抑制自身兔疫反應，也可以通過抑制細胞毒性T細胞活性來減弱對自身成分的細胞毒作用［17-19］。但是，Breg細胞在HA患者發(fā)病機制中的作用不明確，它可能與Treg細胞一起共同參與HA的發(fā)病機制。

本研究通過檢測HA病例組外周血Tfh/Treg/Breg細胞平衡及其相關效應分子，分析Tfh/Treg/Breg細胞兔疫平衡在HA發(fā)生發(fā)展中的作用，探討Tfh/Treg/ Breg細胞平衡與HA患者流產次數(shù)間的關系，為HA的臨床診斷與治療提供新的思路［20］。本研究通過流式細胞術檢測HA病例組和對照組外周血Tfh/Treg/Breg細胞水平，ELISA檢測血清中IL-21、IL-10、TGF-β1水平，結果發(fā)現(xiàn)，HA病例組外周血中Tfh水平高于對照組，而調節(jié)性Treg/Breg的水平降低；HA病例組血清中IL-21水平高于對照組，IL-10/TGF-β1水平低于對照組，且IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值高于對照組，流產次數(shù)大于3次的HA病例組IL-21/IL-10、IL-21/TGF-β1比值高于流產次數(shù)2～3次的HA病例組。研究表明，效應細胞與調節(jié)性細胞異常與自身兔疫病的增強與預防有關［11］，與本研究結果類似，HA病例組外周血Tfh/Treg/Breg平衡及IL-21/IL-10、IL-21/ TGF-β1比值與HA患者流產次數(shù)呈正相關。

綜上所述，本研究提示HA患者體內存在細胞兔疫紊亂，伴隨自身抗體增強，可能引起流產次數(shù)的增多。通過檢測HA病例組外周血Tfh/Treg/Breg細胞平衡及相關效應分子IL-21、IL-10、TGF-β1變化，有助于了解HA患者機體兔疫狀態(tài)，為進一步探索HA的發(fā)病機制提供了新線索，對HA的預防與兔疫調節(jié)治療具有一定的臨床價值。

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Effect of the Tfh/Treg/Breg subsets on the immune disorder of patients with habitual abortion

SHI Jiaoqi1WU Changlin2▲ZHU Yi2ZHANG Jihua1DANG Xintang2ZHOU Xuemin2SHE Jijia2
1.Department of Laboratory，the Peop1e's Hospita1 of Yangxin County，Hubei Province，Yangxin435200，China；2.Department of Laboratory，the Second Peop1e's Hospita1 of Shenzhen City，Guangdong Province，Shenzhen518035，China

R714.21

A

1673-7210（2016）04（c）-0113-04

廣東省醫(yī)學科研基金項目（A2013588）。

2016-01-15本文編輯：任 念）